PCR實驗中的污染預(yù)防及處理

1、PC 讀驗中的污染預(yù)防及處理一.污染的預(yù)防進行 PCR 操作時，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的 PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：1 .標(biāo)本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；2 .PCR 擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR 擴增；3 .產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備 fPCR 擴增-產(chǎn)物分析-產(chǎn)物處理

2、。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR 擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的 DNA 和其他來源的 DNA1 .PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；2 .引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴增產(chǎn)物區(qū)配制；3 .引物和 dNTP 應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標(biāo)明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。（三）實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：1

3、.戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；2 .使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與 PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3 .避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4 .操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；5 .最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；6 .操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證 PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；7 .盡可能用可替換或

4、可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本 DNA 的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);8 .重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。二.追蹤污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰

5、性對照的選擇亦要慎重，因為 PCR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應(yīng)包括 PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括 PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板 DNA 這對監(jiān)測試劑中 PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境

6、污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1 .模板提取時真空抽干裝置；2 .凝膠電泳加樣器；3 .電泳裝置；4 .紫外分析儀；5 .切膠用刀或手術(shù)刀片；6 .離心機；7 .冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去離子水浸泡；3）取 5ml 做 PCR 實驗；4）電泳檢測結(jié)果。8 .氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中 PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）。三.污染處理（一）環(huán)境污染1 .稀酸處理法：

7、對可疑器具用 1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA 脫喋吟；2 .紫外照射（US 法：紫外波長（nm）一般選擇 254/300nm,照射 30min 即可。需要注意的是，選才 IUV 作為消除殘留 PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮 PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對 500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR 產(chǎn)物中喀咤堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是 DNA 鏈中所有喀咤均能形成二聚體，且 UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于 UV 波長，喀咤二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核普酸的序列。在受照射的長 DNA 鏈上

8、，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于 0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型噴咤復(fù)合體，胸腺喀咤乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和 DNA 斷裂等）均可終止 TaqDNA 聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。如果這些位點（0.13/堿基）在 DNA 分子上隨機分布，一個 500bp 片段的 DNA 分子鏈上將有 32 處損傷位點，那么，105 個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果 100bp 的片段，每條鏈上僅有 6 處損傷，105 個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是 UV 照射有一定的片段長度限制的原因。（二）反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：1 .D

9、NaseI 法：PCR 混合液（未加模板和 Taq 聚合酶）加入 0.5UDNaseI,室溫反應(yīng) 30min 后加熱滅活，然后加入小 K 板和 Taq 聚合酶進行正常 PCR 擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染 DNA 的序列；2 .內(nèi)切酶法：選擇識別 4 個堿基的內(nèi)切酶（如 MspI 和 TaqI 等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用 1h 后加熱滅活進行 PCR3 .紫外照射法：未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV 照射法；4 .g 射線輻射法：1.5kGy 的輻射可完全破壞 0.1ng 基因組 DNA2.0kG

10、y 可破壞 104 拷貝的質(zhì)粒分子，4.0kGy仍不影響 PCR 但高于此卜 M 度會使 PCR 擴增效率下降。 引物可受照射而不影響 PCRg 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞 DNA 的。（三）尿喀咤糖普酶（UNG 法由于 UV 照射的去污染作用對 500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的 PCR 擴增片段通常為 300bp 左右，因此 UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1 .原理：在 PCR 產(chǎn)物或引物中用 dU 代替 dTo 這種 dU 化的 PCR 產(chǎn)物與 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿噴咤堿基和糖磷酸骨架間的 N-糖基鍵，可除去 dU 而阻止 TaqDNA

11、聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含 dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈 DNA 中消除尿喀咤，而對 RNA中的尿喀咤和單一尿喀咤分子則無任何作用。2 .dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量 dU。在再次進行 PCR 擴增前，用 UNG 處理 PCR 混合液即可消除 PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于 UNG 在 PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含 dU 的新的PCR 產(chǎn)物。3 .dU 引物法：合成引物時以 dU 代 dT,這樣 PCR 產(chǎn)物中僅 5/端帶 dU。UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb 以上

12、）的擴增用 dUTP 法效率較用 dTTP 低，而用dU 法就可克服這一缺點。dU 引物最好將 dU 設(shè)計在 3,端或近/端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。4 .優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG 處理可以和 PCR 擴增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進行；由于擴增產(chǎn)物中有大量 dU 存在，可徹底消除污染源。5 .需注意的是摻入 dUTP 的 DNA 不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進行 PCR 產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化 UNG-（UNG 缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌 UNG 消化掉。（四）固相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈 RNA 探針與待擴核酸雜交

13、，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非 RNA 探針雜交區(qū)域。第 2）步的漂洗后可用 PCR 檢測以確定標(biāo)本是否被擴增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。（五）RS-PCR 法（RNA-specificPCR）也稱為鏈特異性 PCR 主要指用于 RNA 模板的特異性 PCR 法，該法可明顯降低假陽性而不影響 PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的 3/端（A 區(qū)）有 20 個核音酸左右為模板的特異性互不序列，5/端 20 個核音酸（C 區(qū)）為附加修飾堿基。與 mRN 頌轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA 與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈 cDNA 為模板合成第二鏈cDNA以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)