His-Tag蛋白純化步驟

1、變性條件下從大腸桿菌中純化多聚組氨酸標簽蛋白（主要以包涵體的形式表達）的樣品制備1、用 1XPBS 重懸細胞沉淀（約每毫升沉淀加 5ml1*BS）,并按上述方法進行超聲破菌。2、12000rpm 離心 10min 收集包涵體。若有必要，用 1XPBS 洗包涵體幾次。3、用 Binding/WashBuffer（約每毫升沉淀加 5ml1XPBS）溶解包涵體，并在室溫下孵育 3060 分鐘。若使沉淀充分溶解，有必要進行機械或超聲均質(zhì)。4、12000rpm 離心 30min,取上清至一干凈管中。HisHis 標簽蛋白的重力純化流程1ml 柱子的總體積為 10ml,只需加入介質(zhì)。如果樣品體積大于柱子體

2、積，可重復利用，注意不要超過樹脂的結(jié)合能力。1、平衡柱子的工作溫度。應在室溫或 4c 下進行純化。2、取出底帽，倒出多余的液體，直立固定好柱子，讓柱子頂部朝上。3、用 2 倍樹脂體積的 Binding/WashBuffer 平衡柱子，以 0.51ml/min 的流速過柱。4、從柱子上部加入經(jīng) Binding/WashBuffer 處理的大腸桿菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，讓流出液重新過柱一次，以最大限度地提高結(jié)合力。5、用兩倍樹脂體積的 Binding/WashBuffer 洗滌樹脂并收集流出液。重復該步驟,用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在 280nm 基線處。6、

3、用兩倍樹脂體積的 HutionBuffer 將 His 標簽蛋白從樹脂上洗脫下來。 重復此步驟兩次，并單獨收集每次洗脫出來的液體。7、用 ModifiedCoomassieBradfordAssayKit（NoSK3041）。洗脫的蛋白可直接進行SDS-PAGE 分析。注意：洗脫獲得的蛋白可用凝膠過濾（如 NoBSP090gravityDesaltingColumn）或透析去除咪口坐以便后續(xù)應用。SDS-PAGE 分析前，含 6M 鹽酸月瓜的樣品必須用含 8M 尿素的緩沖液透析。就地清洗方案如果背壓增加或觀察到樹脂明顯污染，通常進行完全性能恢復流程。由于所有的 NI-IDA樹脂的高螯合強度和低

4、金屬浸出率，就地清洗前不需要進行 strippingo 我們建議使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水結(jié)合蛋白和脂蛋白。程序1、用 15 倍樹脂體積的 0.5MNaOH 清洗柱子。考慮到需要 30min 的接觸時間，因此需相應地調(diào)整流量（如用 0.5MNaOH 溶液以 0.5ml/min 的流速洗 1ml 的 NI-IDA 柱，需要相當于 15ml 總體積的量）。2、用 10 倍樹脂體積的 1*BS 重新平衡后，樹脂可馬上使用。若要保存柱子，可加入 2030%乙醇或 10100mM 氫氧化鈉進行 4c 保存。通過洗脫（strippingstripping）和離子重填裝進行再生NI-I

5、DA 柱的洗脫（stripping）和再填裝通常是沒有必要的。如果背壓增加或觀察到樹脂明顯污染，就地清洗過程通?？苫謴托阅堋５粜阅苋圆涣钊藵M意，柱子內(nèi)的 NI-IDA樹脂可用下面的程序進行洗脫（stripping）和離子重填裝。程序1、用 10 倍樹脂體積的洗脫緩沖液（StrippingBuffer）（50mM 磷酸鈉；300mMNaCl;100mMEDTA,pH 值 8.0）洗滌樹脂。2、用 20 倍樹脂體積的去離子水清洗樹脂。3、用 2 倍樹脂體積的 100mMNiSO4（用去離子水配制）進行離子再填裝。4、10 倍樹脂體積的去離子水清洗，并用 10 倍樹脂體積的 1XPBS 重新平衡樹

6、脂，樹脂可馬上使用。若要保存柱子，可加入 2030%乙醇或 10100mM 氫氧化鈉進行 4c保存。問題解答問題可能的原因建議樣品太黏如果純化是在 4c 進行，那改為在室溫下進行。超聲破菌前或超聲破菌后增加細胞裂解物的稀釋度。繼續(xù)超聲破菌，直到黏度卜降；和/或額外加入 DNAse 和流速太慢純化過程中目2+Mg。如果用很黏稠的溶液，將柱子連接到真空管以增加流速添加去垢劑或其他物質(zhì)，緩慢?!合 30min 以增加目的蛋白的可溶性。注意：TritonX-100 和 NP-40（不是 Tween）在280nm 具后高吸光度，此外，去垢劑不能通過緩沖液置的蛋白難溶或換而輕易去除。沉淀包涵體：用常規(guī)變性

7、劑如 46M 鹽酸月瓜、48M 尿素或His-Tag 蛋白沒強變性劑，蛋白很容易從包涵體中溶解（和去折疊）。緩慢?1 合 30min 或更長時間以助溶目的蛋白。額外增加幾星升的 elutionbuffer 進行洗脫有完全被洗脫樣品制備和洗樣品和結(jié)合緩沖液中咪陛濃度太高，使用低濃度的咪陛。確定樣品中螯合劑或強還原劑的濃度不要太高。滌過程中發(fā)現(xiàn)組氨酸標簽可能暴露/、充分；對包涵體，可用尿素或鹽流出液中存在酸月瓜對去折疊的蛋白進行純化。減少樣品的稀釋，增加His-Tag 蛋白產(chǎn)量低His-Tag 蛋白固體尿素或鹽酸月瓜。組氨酸標簽丟失。檢查結(jié)構(gòu)的序列。His-Tag 蛋白仍然被結(jié)合。洗脫液中用高濃度的的咪陛進純化過程中行洗脫目的蛋白沉淀在柱子中，減少樣品的量；His-Tag 蛋白沒洗脫過程中降低咪陛的量。嘗試去垢劑或改變 NaCl 的濃后被洗脫卜來度或在變性（蟲折疊）條件下洗脫。非特異性疏水或其洗脫的樣品和緩沖液它互作。在洗脫緩沖液中加入非離子去垢劑或增加 NaCl 的濃度。樣品和緩沖液中使用高濃度的咪陛以阻止雜蛋白結(jié)合。His-Tag 蛋中咪門坐的濃度推薦使用 2040mM,但更局濃度可能也適合。白不純太低未結(jié)合物質(zhì)洗樣品制備后重復洗滌步驟以獲得最佳純度滌不充分His-Tag 蛋白被增加蛋白酶抑制劑（避免含 EDT