精氨酸加壓素及其受體對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞iNOS

1、精氨酸加壓素及其受體對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞iNOS【關(guān)鍵詞】精氨InfluencesofargininevasopressinanditsreceptorsoniNOSNOsystemactivityincardiacfibroblastsAbstractAIM:Toexploretheinfluencesofargininevasopressin(AVP)anditsreceptorsoninduciblenitricoxidesynthasenitricoxide(iNOSNO)systemactivityincardiacfibroblasts(CFs).XETHODS:AfterCFsw

2、ereisolatedandcultured,nitricacidreductasemethod,spectrophotometryandRTPCRwereusedtodetectthechangesofiNOSNOsystemactivityinducedbyAVPanditsreceptors.RESULTS:AVPsignificantlyenhancedCFsiNOSNOsystemactivity.VIreceptorantagonistinhibitediNOSXOsystemactivityinaconcentrationdependentmannerand1X10-7mol/L

3、VIreceptorantagonistdecreasediNOSNOsystemactivitytothecontrollevel.VIreceptorantagonistandV1+V2receptorantagonisthadthesameeffectsoniNOSNOsystemactivity.CONCLUSION:VIreceptorantagonistmediatediNOSNOsystemactivityincreasesinAVPinducedCFs.VIreceptorantagonistmaybeanewtargetinthepreventionandreversiono

4、fcardiacremodeling.Keywordscardiacfibroblasts;argininevasopressin;argininevasopressinreceptors;nitricoxide【摘要】目的：探討精氨酸加壓素(AVP)及其受體對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFs)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶一氧化氮(iNOSXO)系統(tǒng)活性的阻礙.方式：分離培育SD仔鼠CFs,采納硝酸還原酶法、分光光度法和RTPCR觀看AVP及其受體拮抗劑對(duì)CFsiXOSNO系統(tǒng)活性的阻礙.結(jié)果：AVP顯著提高CFsiNOSXO系統(tǒng)活性.VI受體拮抗劑呈劑量依托性地抑制AVP的這一作用，其中1X10-7mol/

5、LVI受體拮抗劑可將AVP誘導(dǎo)下CFs的iNOSNO系統(tǒng)活性抑制到基礎(chǔ)狀態(tài)水平.V1+V2受體拮抗劑具有與VI受體拮抗劑相似的作用.結(jié)論：AVP干與下CFsiNOSNO系統(tǒng)活性增強(qiáng)由VI受體介導(dǎo)，VI受體可望成為阻斷或逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的新靶點(diǎn).【關(guān)鍵詞】心肌成纖維細(xì)胞；精氨酸加壓素；精氨酸加壓素受體；一氧化氮0引言心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts,CFs)過(guò)度增殖和膠原合成份泌過(guò)量是心臟重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)，一氧化氮（NO）可通過(guò)抑制CFs過(guò)度增殖和膠原合成份泌過(guò)量抑制心臟重構(gòu)1-2.精氨酸加壓素（argininevasopressin,AVP）能夠誘導(dǎo)CFs誘導(dǎo)型一氧化氮合酶一

6、氧化氮（iNOSNO）系統(tǒng)活性增加3,NO合成增多.但AVP如何將這種細(xì)胞外信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，目前尚不清楚.心肌組織有AVP受體表達(dá)，AVP受體分為VI和V2兩種類型4.AVP干與下CFsiNOSNO系統(tǒng)活性增加由哪一種受體介導(dǎo)尚少見(jiàn)報(bào)導(dǎo).咱們用AVP受體拮抗劑干與AVP誘導(dǎo)下的CFs,觀看其對(duì)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性的阻礙，以了解AVP誘導(dǎo)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性增加的信息傳遞途徑，為防治心臟重構(gòu)提供新的思路.1材料和方式材料實(shí)驗(yàn)用SD仔鼠（誕生13d,第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心）；AVP（美國(guó)PeninsularLab）；VI受體拮抗劑、V1+V2受體拮抗劑（Sigma公司）;NO含量和NO

7、S活性測(cè)定試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）；TRIZOL裂解液、Oligo（dT）,MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）;TaqDNA聚合酶（寶生物公司）；PCR引物由上海生物工程公司合成.方式的分離、培育和鑒定無(wú)菌條件下取SD仔鼠心室，鹽水漂洗后剪至23mm3小塊.g/L胰蛋白酶37消化20、40min,搜集細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心.將所得細(xì)胞沉淀物懸浮于含100mL/L小牛血清的DMEM培育液中，吹打分散后置于37,50mL/LC02孵箱中貼壁60、90min,差速貼壁法去除心肌細(xì)胞.培育細(xì)胞長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí)傳代.實(shí)驗(yàn)用23代細(xì)胞.對(duì)CFs進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色：纖

8、維連接蛋白染色陽(yáng)性，血管滑膩肌肌動(dòng)蛋白染色陰性，符合CFs染色特點(diǎn).實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AVP組(1X10-7mol/L),AVP+V1受體拮抗劑組(IX10-9,1X10-8,1X10-7mol/L)和AVP+V1+V2受體拮抗劑組(1X10-7mol/L).CFs培育至近融合狀態(tài)時(shí)無(wú)血清培育液馴化24h,繼之分組培育24h搜集培育液測(cè)定N0含量和NOS活性，搜集細(xì)胞測(cè)定iNOSmRNA表達(dá)量.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.含量測(cè)定利用硝酸還原酶將N03-還原為N02-,通過(guò)比色法測(cè)定N02-濃度推算N0含量.操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.活性測(cè)定N0與親核物質(zhì)生成有色化合物，通過(guò)NOS催化產(chǎn)生的N0量推算

9、NOS活力.操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.mRNA表達(dá)量測(cè)定按TRIZOL試劑說(shuō)明書提取CFs總RNA.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.其中鼠iNOS上下游引物序列別離為tcgagccctggaagacccacatct和gttgttcttcttccaaggtgtttgccttat,PCR產(chǎn)物為276bp.鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上下游引物序列別離為tattgggcgcctggtcacca和ccaccttcttgatgtcatca,PCR產(chǎn)物為746bp.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行圖像分析，以iNOSmRNA/GAPDHmRXA電泳帶熒光強(qiáng)度比值作為iNOSmRNA表達(dá)

10、量指標(biāo).統(tǒng)計(jì)學(xué)處置：數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)分析.多組均數(shù)比較采納F查驗(yàn)，組間比較采納LSD法，P<表示不同有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果及其VI受體拮抗劑對(duì)CFsNOS活性和NO含量的阻礙對(duì)照組CFs具有NOS活性，能夠合成NO.AVP干與下CFsNOS活性顯著增強(qiáng),NO含量顯著增高（P<.VI受體拮抗劑呈劑量依托性地抑制CFs的NOS活性和NO含量，其中1X10-7mol/LVI受體拮抗劑可將AVP誘導(dǎo)下CFs的NOS活性和N0含量抑制到與對(duì)照組相近水平（P>,圖1A,B）.及其VI受體拮抗劑對(duì)CFsiNOSmRXA表達(dá)的阻礙

11、對(duì)照組CFs有iNOSmRXA表達(dá)士.AVP干與下CFsiNOSmRXA表達(dá)顯著增強(qiáng)土，p<.VI受體拮抗劑呈劑量依托性地抑制CFsiNOSmRNA表達(dá)Q義10-9mol/L：±1X10-8mol/L：±1X10-7mol/L：±.其中1X10-7mol/LVI受體拮抗劑可將AVP誘導(dǎo)下CFs的iNOSmRNA表達(dá)抑制到與對(duì)照組相近水平（P&gt圖2）.受體拮抗劑與V1+V2受體拮抗劑對(duì)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性阻礙的比較V1+V2受體拮抗劑與VI受體拮抗劑都可將AVP誘導(dǎo)下CFsiNOSmRXA表達(dá)土和土,NOS活性（417±17

12、5和500±183）ukat/L和NO含量（34±14和36土12）umol/L抑制到與對(duì)照組土，（450±83）Ukat/L和（29±5）口mol/L相近水平，二者間不同無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.3討論AVP是下丘腦分泌的九肽神經(jīng)內(nèi)分泌激素，機(jī)體許多組織細(xì)胞膜上都有AVP特異性受體存在.AVP通過(guò)與其特異性受體結(jié)合，激活不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)，發(fā)揮不同的生物效應(yīng).依照AVP受體后信號(hào)傳遞的第二信使系統(tǒng)不同，將AVP受體分為VI（第二信使為蛋白激酶C）和V2（第二信使為蛋白激酶A）兩種類型5,VI和V2受體都有自己特異性的受體拮抗劑.AVP受體拮抗劑是研究AVP生

13、理作用的有效藥理工具，心肌組織中有VI,V2兩種AVP受體表達(dá)6,AVP應(yīng)該通過(guò)其受體作用改變CFsiNOSNO系統(tǒng)活性.咱們采納AVP受體拮抗劑干與AVP誘導(dǎo)下的CFs,結(jié)果發(fā)覺(jué)：基礎(chǔ)狀態(tài)下CFs有iNOSmRNA表達(dá)，具有NOS活性，能夠合成必然量的NO.1X10-7mol/LAVP顯著提高CFsiNOSmRNA表達(dá)，增強(qiáng)NOS活性，增加NO合成；VI受體拮抗劑呈劑量依托性地抑制AVP對(duì)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性的提高作用，其中1X10-7mol/LVI受體拮抗劑可將AVP對(duì)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性的提高作用抑制到與基礎(chǔ)狀態(tài)相近；V1+V2受體拮抗劑和VI受體拮抗劑對(duì)CFsiNOSNO系

14、統(tǒng)活性的抑制作用相似，說(shuō)明AVP對(duì)CFsiNOSNO系統(tǒng)活性的提高作用要緊由VI受體介導(dǎo).心臟重構(gòu)致使心肌收縮力下降、舒張功能消退和心電紊亂，是心力衰竭、心律失常和心性猝死發(fā)生的重要環(huán)節(jié)7.AVP干與下CFsNO合成增加具有重要的病理生理意義.最近幾年研究發(fā)覺(jué)心臟組織自身能夠合成AVP8,在心肌梗死、高血壓性心臟病、心力衰竭等臨床病理情形下，心肌組織中AVP含量顯著增高9,AVP含量增高能夠誘導(dǎo)CFsNO合成增加，NO合成增加抑制了上述病理情形下CFs異樣增殖和膠原合成份泌過(guò)量，從而抑制心臟重構(gòu).因此，AVP干與下CFsNO合成增加是心臟組織自身對(duì)病理性損傷的一種自我愛(ài)惜機(jī)制.咱們的實(shí)驗(yàn)證明V

15、I受體介導(dǎo)了AVP干與下CFsiNOSNO系統(tǒng)活性提高的調(diào)劑,提示VI受體有可能成為爾后阻斷或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的一個(gè)新的作用靶點(diǎn).【參考文獻(xiàn)】1 WeberKT.Awhisperonthewindspawnsastormj.CardiovascRes,2000,46(2):211-213.2 RossiMA,RamosSG,PradoCM.Chronicinhibitionofnitricoxidesynthaseinduceshypertensionandcardiomyocytemitochondrialandmyocardialcollagenremodellingintheabsence

16、ofhypertrophyj.JHypertens,2003,21(5):993-1001.3范延紅，趙連友，楊學(xué)東，等.核因子KB在精氨酸血管升壓素誘導(dǎo)大鼠心肌成纖維細(xì)胞一氧化氮合成中的作用J.生理學(xué)報(bào)，2003,55(4):417-421.4 KaygisizZ,KabadereTE,DernekS,etal.Theeffectsofvasopressininisolatedratheartsj.IndianJPhysiolPharmacol,2001,45(1):54-62.5 ChatterjeeK.Neurohormonalactivationincongestiveheartfailureandtheroleofvasopressinj.AmJCardiol,2005,95(9A):8B-13B.6 ThibonnierM.VasopressinreceptorantagonistsinheartfailureJ.CurrOpinPharmacol,2003,3(6):683-687.7 WeberKT.Cardioreparationinhypertensiveheartdiseasej.Hypertension,2001,38(3Pt2):588-591.8 LuLM,WangJ,YaoT.Chang