化學發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、 全自動化學發(fā)光免疫分析儀一、一、化學發(fā)光的發(fā)展史化學發(fā)光的發(fā)展史二、二、化學發(fā)光免疫分析基本原理化學發(fā)光免疫分析基本原理三、化學發(fā)光免疫分析的類型三、化學發(fā)光免疫分析的類型四、國內(nèi)外產(chǎn)品展示四、國內(nèi)外產(chǎn)品展示一、化學發(fā)光的發(fā)展史1.免疫診斷技術(shù)的發(fā)展歷程免疫診斷技術(shù)的發(fā)展歷程放射免疫測定化學發(fā)光技術(shù)的建立2.國際主流化學發(fā)光免疫分析儀的原理、技術(shù)及特點國際主流化學發(fā)光免疫分析儀的原理、技術(shù)及特點微粒子捕捉酶免疫分析技術(shù) 熒光偏振免疫分析技術(shù)利用化學發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合采用酶聯(lián)免疫、生物素親和素和增強化學發(fā)光技術(shù)化學發(fā)光免疫分析的優(yōu)勢靈敏度高靈敏度高 靈敏度高是化學發(fā)光免疫分析關(guān)

2、鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）。化學發(fā)光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出的物質(zhì)，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 寬的線性動力學范圍寬的線性動力學范圍 發(fā)光強度在 4 6 個量級之間與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然 RIA 也有較寬的線性動力學范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。 光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長輝光型的 CLIA 產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。 分析方法簡便快速分析方法簡便快速絕大多數(shù)分析

3、測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差小結(jié)果穩(wěn)定、誤差小樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長安全性好及使用期長免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達一年。 二、化學發(fā)光免疫分析基本原理 化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標記物質(zhì)標記在抗原或抗體上, 經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復合物。然后進行對標記物進行檢測, 來測定待檢物?；瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)

4、經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體, 當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時, 同時發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號測量儀器光量子產(chǎn)率。2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原2抗體復合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據(jù)其檢測方法可分為非標記免疫分析和標記免疫分析。非標記免疫分析是利用抗原與抗體結(jié)合形成抗原2抗體復合物后, 其理化性質(zhì)發(fā)生改變,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測待檢物。標記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上將標記物質(zhì)標記在抗原或抗體上, 然后進行免疫反應(yīng)形成抗原2抗體復合物, 再對標記質(zhì)進行檢測, 從而間接檢

5、測待檢物的方法 。目前常用的標記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等。2.2 化學發(fā)光原理 化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學物質(zhì)在特定化學反應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學反應(yīng)中激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個化學發(fā)光反應(yīng)包括兩個過程:激發(fā)和發(fā)光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會通過系間串躍和系內(nèi)串躍而消失。因此,化學發(fā)光反應(yīng)的效率是: CL =CEEM (1) 式中,CL為化學發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的

6、發(fā)光效率。CE和EM分別定義為：CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (2)EM = 發(fā)光的分子數(shù)/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù) (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學發(fā)光的效率CL等價于生成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (4)2.3 化學發(fā)光免疫分析的原理 化學發(fā)光免疫分析法是化學發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。它同時具有化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光反應(yīng)的試劑標記抗原或抗體, 標記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟,最后以測定發(fā)光強度形式測定待測物的含量。三、化學發(fā)光免疫分析的類型

7、化學發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標記物的不同可分為三大類,即化直接化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析法。 用吖啶酯直接標記抗體用吖啶酯直接標記抗體( (抗原抗原) )，與待測標本中相，與待測標本中相應(yīng)的抗原應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（入氧化劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。3.1 3.1 直接

8、化學發(fā)光免疫分析直接化學發(fā)光免疫分析發(fā)光發(fā)光YYY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶吖啶酯帶吖啶酯標記物抗標記物抗體體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化學發(fā)光的機理直接化學發(fā)光的機理磁磁微粒微粒模式圖模式圖Y YY YY Y Y YY Y Y YY YY YY YY YY YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特點特點 抗原和抗體結(jié)抗原和抗體結(jié)合與未合與未結(jié)合結(jié)合部分部分的的易易分離分離磁微粒磁微粒技術(shù)技術(shù) 化學

9、發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶）是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標記抗原或抗來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體固相包被抗體- -待測抗原待測抗原- -酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱

10、讀系統(tǒng)接，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈兪?，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。3.23.2、化學發(fā)光酶免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標）標記抗體記抗體(或抗原或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標記抗體復合）標記抗體復

11、合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。 辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標記抗體標記抗體(或抗原或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶標記抗體復合物，這時加入標記抗體復合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，發(fā)光劑，堿性磷酸

12、酶使堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。脫去磷酸根基團而發(fā)光。 堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 分配樣品分配樣品,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育孵育使反應(yīng)物使反應(yīng)物結(jié)合結(jié)合在磁場中在磁場中清洗去除清洗去除未結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合物質(zhì)加入加入底物底物產(chǎn)生產(chǎn)生信號信號孵育孵育,促使信號促使信號的產(chǎn)生的產(chǎn)生信號信號檢測檢測電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在