【參考借鑒】細(xì)胞庫建立標(biāo)準(zhǔn).doc

1、細(xì)胞庫建立概況一、對細(xì)胞庫細(xì)胞基質(zhì)總的要求(一)細(xì)胞系/株歷史資料1 .細(xì)胞系/株來源資料應(yīng)具有細(xì)胞系/株來源的相關(guān)資料,如細(xì)胞系/株制備機(jī)構(gòu)的名稱,細(xì)胞系/株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料.這些資料最好從細(xì)胞來源實驗室獲得,也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn).人源細(xì)胞系/株須具有細(xì)胞系/株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別及生理狀況的相關(guān)資料.動物來源的細(xì)胞系/株須具有動物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資料.2 .細(xì)胞系/株培養(yǎng)歷史的資料應(yīng)具有細(xì)胞別離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及建立細(xì)胞系/株過程的相關(guān)資料,包括所使用的物

2、理、化學(xué)或生物學(xué)手段,是否有外源添加序列,以及細(xì)胞生長特征、生長液成分、選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等.同時還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢測結(jié)果的相關(guān)資料.應(yīng)提供細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分.如使用人或動物源成分,如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物學(xué)活性的物質(zhì),應(yīng)具有這些成分的來源、制備方法、質(zhì)量限制、檢測結(jié)果和質(zhì)量保證的相關(guān)資料(二)細(xì)胞庫的建立細(xì)胞庫的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供已標(biāo)定好的、細(xì)胞質(zhì)量相同的及能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞種子.1 .原材料的選擇建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定中相關(guān)規(guī)定.神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于生物制品生產(chǎn).培養(yǎng)細(xì)胞用牛血清應(yīng)來源于

3、無牛腦海綿體腦病流行地區(qū)的健康牛群,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合規(guī)定(附錄RIIID).不得使用人血清作為細(xì)胞培養(yǎng)液.如需使用人血白蛋白,那么須使用有批準(zhǔn)文號的合格制品.消化細(xì)胞用胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測,證實其無細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染.特別應(yīng)檢測胰蛋白酶來源的動物可能攜帶的病毒,如細(xì)小病毒等.用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或3-內(nèi)酰胺(3-Lactam)類抗生素.2 .細(xì)胞培養(yǎng)操作的要求細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體.在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前,不得操作或接觸有感染性的微生物或動物.3 .建立細(xì)胞庫細(xì)胞庫為三級治理,即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫及工作

4、細(xì)胞庫.如為引進(jìn)的細(xì)胞,可采用主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的二級細(xì)胞庫治理.在某些特殊情況下,也可使用主細(xì)胞庫一級庫,但須得到國務(wù)院藥品監(jiān)督治理部門的批準(zhǔn).(1)原始細(xì)胞庫(PCB)由一個原始細(xì)胞群體開展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體,或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體,通過檢定證實適用于生物制品生產(chǎn)或檢定.在特定條件下,將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液,定量均勻分裝于安甑,于液氮或一130c以下凍存,即為原始細(xì)胞庫,供建立主細(xì)胞庫用.(2)主細(xì)胞庫(MCB)取原始細(xì)胞庫細(xì)胞,通過一定方式進(jìn)行傳代、增殖后均勻混合成一批,定量分裝,保存于液氮或一130c以下.這些細(xì)胞必須按其特定的質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定,全部合格

5、后即為主細(xì)胞庫,供建立工作細(xì)胞庫用.(3)工作細(xì)胞庫(WCB)工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由MCB細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成.由MCB的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖,到達(dá)一定代次水平的細(xì)胞,合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液,定量分裝于安甑,保存于液氮或一130c以下備用,即為工作細(xì)胞庫.凍存時細(xì)胞的傳代水平須保證細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個亞批制品.復(fù)蘇后的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次.所制備的WCB必須經(jīng)檢定合格,方可用于生產(chǎn).4 .細(xì)胞庫的治理每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺賬,記錄放置位置、容器編號、分裝及貯存安甑數(shù)量,取用記錄等.細(xì)胞庫中的每支細(xì)胞安甑均應(yīng)注明細(xì)胞系/株名、代次、安甑號、凍存

6、日期,貯存容器的編號等.凍存的細(xì)胞存活率應(yīng)在90%以上.凍存后的細(xì)胞,應(yīng)至少做一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期,檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況.主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫分別存放.非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放.三細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定細(xì)胞檢定主要包括以下幾個方面：細(xì)胞鑒別、外源因子污染和內(nèi)源因子的檢測、致瘤性檢測等.必要時還須進(jìn)行細(xì)胞染色體核型檢查.這些檢測內(nèi)容對于MCB細(xì)胞和WCB細(xì)胞均適建立細(xì)胞庫的實驗室應(yīng)至少進(jìn)行一次MCB細(xì)胞的全面檢定,檢定應(yīng)包括：細(xì)胞鑒別試驗,細(xì)菌、真菌檢查,支原體檢查,外源病毒因子檢查等.每次建立WCB后,均應(yīng)按規(guī)定工程進(jìn)行檢定.1 .細(xì)胞鑒別試驗新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫

7、MCB和WCB和生產(chǎn)結(jié)束時的細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗,以確認(rèn)為本細(xì)胞,無其他細(xì)胞的交叉污染.細(xì)胞鑒別試驗方法有多種,包括細(xì)胞遺傳檢測如特征染色體標(biāo)志卜遺傳標(biāo)志檢測如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核昔重復(fù)序列卜免疫學(xué)檢測如組織相容性抗原、種特異性抗血清和生物化學(xué)鑒別法如同工酶試驗等.可選其中一種或幾種方法,但均須經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可.細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特征相結(jié)合來判斷,更有利于細(xì)胞鑒別.2 .細(xì)菌、真菌檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品3 .支原體檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品,應(yīng)為陰性.4 .細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查應(yīng)注意檢查細(xì)胞系/株中是否有細(xì)胞來源物種中潛在的可傳染的病毒,以及由于操作帶入的外源性病毒

8、.對細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法,須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來源及細(xì)胞特性決定.1細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗簡稱血吸附試驗取混合瓶細(xì)胞樣品,接種至少6個細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,待細(xì)胞長成單層后換維持液,持續(xù)培養(yǎng)兩周.每日鏡檢細(xì)胞,細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征.細(xì)胞至少培養(yǎng)14天后,分別取1/3細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,用02%0.5%豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗.參加紅細(xì)胞后置48c30分鐘,然后置2025c30分鐘,分別進(jìn)行鏡檢,觀察紅細(xì)胞吸附情況,結(jié)果應(yīng)均為陰性.新鮮紅細(xì)胞在28c保存不得超過7天,且溶液中不應(yīng)含有鈣離子或鎂離子.2不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子自MCB或WCB來源的細(xì)胞,

9、分別接種以下三種單層細(xì)胞,包括猴源細(xì)胞、人源二倍體細(xì)胞和同種不同批的細(xì)胞.每種單層細(xì)胞接種至少10000000個活細(xì)胞或裂解細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液,每種細(xì)胞至少接種2瓶.接種樣品量應(yīng)占維持液的1/4以上,培養(yǎng)至少14天.取培養(yǎng)7天的上清液各一瓶,分別接種于同種細(xì)胞培養(yǎng),盲傳一代,繼續(xù)培養(yǎng)7天,觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗.假設(shè)待檢細(xì)胞可支持人巨細(xì)胞病毒CMV的生長,那么應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察28天,應(yīng)無細(xì)胞病變.同時,應(yīng)進(jìn)行血吸附病毒檢測,應(yīng)為陰性.3接種動物和雞胚法檢測病毒因子MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞,須采用動物體內(nèi)接種法進(jìn)行

10、外源病毒因子檢測.選用乳鼠、成鼠和雞胚兩組不同日齡共計4組,按表1所列方法進(jìn)行試驗和觀察.如試驗到期有80%以上動物或雞胚健存,此試驗成立,結(jié)合其他檢測確定結(jié)果.對于新建細(xì)胞系/株,還應(yīng)接種豚鼠和家兔見表1.豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌,在注射前觀察4周,結(jié)核菌素試驗為陰性者方可用于試驗.家兔主要用于檢測猴來源細(xì)胞中是否存在B病毒污染,也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替.動物組要求數(shù)量接種途徑細(xì)胞濃度/個活細(xì)胞mlX接種細(xì)胞液量/ml只-觀察天數(shù)結(jié)果判定乳鼠24小時內(nèi)102窩腦內(nèi)腹腔>107O.01O.121應(yīng)健存成鼠1520g10腦內(nèi)腹腔>2R1060.03O.521應(yīng)健存雞胚911

11、日齡10尿囊腔>5R106O.234尿液血凝試驗陰性雞胚56日齡10卵更囊>2R106O.55應(yīng)存活豚鼠350500g5腹腔>4R1055.O42應(yīng)健存,解剖無結(jié)核病變家兔1.52.5kg5皮T皮內(nèi)>2R10s9.0O.1X1021無異常,健存4逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測可采用以下方法對MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測.逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定采用敏感的方法,如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法PERT或其他檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法,檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性.透射電鏡檢查收集待檢細(xì)胞,低速離心后,棄上清,沉淀中應(yīng)

12、含有1X107個細(xì)胞,且細(xì)胞存活率應(yīng)不低于99%.在沉淀中參加固定劑,于4c保存或直接包埋后制備超薄切片,置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察.感染性試驗將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞,培養(yǎng)后檢測.根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源,須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗.這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度,因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測.假設(shè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時,建議進(jìn)行透射電鏡檢查或感染性試驗,以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒.因此,對于人一鼠雜交瘤細(xì)胞系那么應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測.如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系,那么可不檢測特異

13、性的逆轉(zhuǎn)錄病毒,但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序.5特殊外源病毒因子的檢測應(yīng)對MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒的檢測.檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬、組織來源等確定.如鼠源的細(xì)胞系,可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗,檢測其種特異病毒.人源的細(xì)胞系/株,那么應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒.在某些情況下,也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測,如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒.這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù).5 .致瘤性檢查某些傳代細(xì)胞系已證實具有致瘤性,如來源于嚙齒類的細(xì)胞系BHK21、CHO、C127胞等,或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞,如雜交

14、瘤細(xì)胞,那么可不必做致瘤性檢查.某些傳代細(xì)胞系已證實在一定代次內(nèi)不具有致瘤性,而超過某代次那么具有致瘤性,如Vero細(xì)胞,那么必須進(jìn)行致瘤性檢查.人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系/株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查.另外,新建細(xì)胞系/株必須進(jìn)行致瘤性檢查.在某些情況下,用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查.將來源于MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞的增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次,再進(jìn)行致瘤性試驗.下述兩種致腫瘤性試驗方法可任選其一：裸鼠至少10只,將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中,使細(xì)胞濃度為每lml含5X107個細(xì)胞,每只裸鼠皮下注射或肌內(nèi)注射O.2ml;同時用Hela細(xì)

15、胞或HeP-2細(xì)胞設(shè)立陽性對照,陽性對照組至少10只,每只注射0.2ml含106個細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對照,陰性對照組至少10只,每只注射0.2ml含107個細(xì)胞.新生小鼠35日齡,8lOg小鼠10只,在出生后第0天、2天、7天和第14天,分別用O.1ml抗胸腺血清ATS或球蛋白處理,然后同上每只皮下接種107個活細(xì)胞.并設(shè)立陽性對照組,對照組至少接種10只.結(jié)果判定：定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成,且形成的任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記錄.陽性對照組至少有9只有進(jìn)行性腫瘤生長時,試驗視為有效.如試驗組動物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶,應(yīng)觀察至少12周；假設(shè)出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開

16、始消退,那么應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前,處死動物并進(jìn)行解剖做病理及組織學(xué)檢查.未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物,半數(shù)動物應(yīng)觀察21天,剖檢,另外半數(shù)動物應(yīng)觀察12周,進(jìn)行病理檢查,剖檢接種部位,觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成,如有疑心,進(jìn)行病理組織檢查,不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成.除上述體內(nèi)法外,也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養(yǎng)試驗等體外法檢測,特別適用于低代次時,動物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系.四生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境,應(yīng)符合本規(guī)程"一、二細(xì)胞庫的建立"中有關(guān)規(guī)定.從凍存的WCB中取出一支或多支安甑,混合后培養(yǎng),傳至一定代次后供生產(chǎn)用.其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次

17、.從WCB取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存或再用于生產(chǎn).體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計算二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增PopulationDoubling計算,以每個培養(yǎng)容器細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為根底,每增加一倍作為一世代,即一瓶細(xì)胞傳二瓶1:2分種率,再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶1:4為二世代；一瓶傳八瓶1:8那么為三世代.生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前2/3內(nèi).傳代細(xì)胞系那么以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代,每傳一次為一代.二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求傳代細(xì)胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來,可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng),能大規(guī)模生產(chǎn).這些細(xì)胞可無限傳代,但到一定代次后,致瘤性會增強(qiáng).所以對生產(chǎn)用

18、傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查.應(yīng)按本規(guī)程"一、三細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查.對生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下：1 .用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系,代次都有一定限制.用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次,須經(jīng)批準(zhǔn).2 .在生產(chǎn)末期進(jìn)行外源病毒因子檢測對手病毒類制品,茬生產(chǎn)末期,對照細(xì)胞應(yīng)按本規(guī)程"一、三4.1細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗"規(guī)定進(jìn)行血吸附病毒檢查.對于在不同時間收集合并的培養(yǎng)物,應(yīng)在每次收集時檢測對照細(xì)胞培養(yǎng)物.三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求新建的人二倍體細(xì)胞株必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎兒父母的

19、年齡、職業(yè)及健康良好的證實醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證實,以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史的書面調(diào)查資料.人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期,選擇適當(dāng)世代水平28世代增殖出大量細(xì)胞,定量分裝后,置液氮中或一130c下凍存,供建立PCB之用,待全部檢定合格后,即可正式定為PCB,供制備MCB用.1.染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查.對于已建株的人二倍體細(xì)胞株,如WI-38、MRC-5、2BS、KMB17等,在建立MCB時可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查.但如對細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾,那么須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查.1染色體檢查新細(xì)胞建

20、株過程中,每812世代應(yīng)做一次染色體檢查,一株細(xì)胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中,至少應(yīng)有4次染色體檢查結(jié)果.每次染色體檢查,應(yīng)至少隨機(jī)取1000個分裂中期細(xì)胞,進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查,并做記錄以備復(fù)查.其中至少選擇50個分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相,作出核型分析,并應(yīng)粗?jǐn)?shù)500個分裂中期細(xì)胞,檢查多倍體的發(fā)生率.每次染色體檢查,應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞,混合后進(jìn)行再培養(yǎng),制備染色體標(biāo)本片.染色體片應(yīng)長期保存,以備復(fù)查.可用G分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個中期細(xì)胞染色體帶型,應(yīng)用照相圖片作出帶型分析.2判定標(biāo)準(zhǔn)對1000個和500個中期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查,合格的上限可信限90%Pois

21、on法如表2.表2人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn)I檢查細(xì)胞數(shù)I異常II|1000|500|100|染色單體和染色體斷裂|47|26|8|結(jié)構(gòu)異常I17|10|2|超二倍體I8|5|2|亞二倍體I180|90|18|多倍體I30|17|4|亞二倍體如超過上限,可能因制片過程中人為喪失染色體,應(yīng)選同批號標(biāo)本重新計數(shù).一個中期細(xì)胞內(nèi)超過53條染色體,即為一個多倍體.2 .無菌檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物,應(yīng)進(jìn)行無菌檢查附錄XUA.3 .支原體檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物,應(yīng)進(jìn)行支原體檢查附錄XUB.4 .病毒檢查二倍體細(xì)胞株傳代過程中,至少對2個不同世代水平進(jìn)行病毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒、艾滋

22、病病毒檢查等,結(jié)果應(yīng)均為陰性.5 .致瘤性檢查每812世代應(yīng)做一次致瘤性檢查方法見本規(guī)程"一、三5.致瘤性檢查",結(jié)果應(yīng)無致瘤性.6.生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)物檢查1染色體檢查可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝,確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物的染色體檢查.通常,含有活細(xì)胞的制品或純度缺乏的制品,應(yīng)對所用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色體檢查及評價見本規(guī)程"三、1.染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)".但如采用已建株的人二倍體細(xì)胞生產(chǎn),那么不要求進(jìn)行染色體核型檢查.2細(xì)胞鑒別試驗按本規(guī)程"一、三細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定"中細(xì)胞鑒別試驗進(jìn)行.3無菌檢查祓附錄XUA進(jìn)行,應(yīng)符合規(guī)定.4支原體

23、檢測按附錄XUB進(jìn)行,應(yīng)為陰性.5正常細(xì)胞外源病毒因子檢測制備病毒類制品時,于接種病毒的當(dāng)天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時,留取此批細(xì)胞的2%5%的細(xì)胞不接種病毒,換維持液作為正常細(xì)胞對照.與接種病毒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng),并按本規(guī)程"一、三4.1細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗"和"2不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子的規(guī)定進(jìn)行外源病毒污染檢查.四、重組細(xì)胞的特殊要求重組細(xì)胞,系通過DNA重組技術(shù)獲得的含有特定基生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程因序列的細(xì)胞系,因此重組細(xì)胞系的建立應(yīng)具有細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方法的相關(guān)資料,如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、篩選、集落別離、克隆、基因擴(kuò)增

24、及培養(yǎng)條件或培養(yǎng)液的適應(yīng)性等方面的資料.細(xì)胞庫細(xì)胞的4查應(yīng)按本規(guī)程"一、三細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行,但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查：1 .細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞系用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料,包括重組細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性,以及一定條件下保存時細(xì)胞生產(chǎn)目的產(chǎn)品水平的穩(wěn)定性等資料.2 .鑒別試驗除按本規(guī)程"一、三1.細(xì)胞鑒別試驗"進(jìn)行外,還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進(jìn)行鑒別試驗.3 .重組細(xì)胞產(chǎn)物的外源病毒因子檢測應(yīng)按本規(guī)程"一、三4.1細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗"和"2不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢病毒因子的規(guī)定對細(xì)胞裂解物或收獲液及生產(chǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行外源病毒因子的檢測.五、原代細(xì)胞的要求原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動物臟器組織或胚胎,包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗腎或動物的胎兒和其他組織,以及雞胚和鶴鶉胚等正常組織,以適當(dāng)?shù)南合?、?/p>