第1篇第08章--代謝平衡試驗和物質(zhì)代謝試驗

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第八章 代謝平衡試驗與物質(zhì)代謝試驗平衡試驗葡萄糖氧化率同位素示蹤代謝試驗蛋白質(zhì)代謝的動力學(xué)研究糖代謝的動力學(xué)研究鈣代謝研究代謝平衡試驗（metabolic balance study）是研究物質(zhì)在體內(nèi)代謝的一種重要方法。在十六世紀(jì)，Santorio Sanctorius對非顯性出汗的研究開創(chuàng)了代謝平衡研究的先河。之后，von Wendt以自身為研究對象，于1905年發(fā)表了第一篇代謝平衡研究論文。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，代謝平衡試驗研究得到不斷深入和發(fā)展，人們對體內(nèi)各種物質(zhì)代謝過程的了解亦逐漸加深。目前，這一試驗已被廣泛應(yīng)用于各種條件下的物質(zhì)代謝研究。代謝平衡試驗的目的是了

2、解某種物質(zhì)在體內(nèi)的吸收、分布、排泄的代謝過程，探討疾病的病因和病理。代謝平衡試驗適應(yīng)癥有：各種生理情況、疾病條件下糖、蛋白質(zhì)、脂肪、電解質(zhì)、礦物質(zhì)和微量元素的代謝環(huán)節(jié)、定位和代謝量與途徑，以及藥物或毒物的吸收或代謝等。但多汗、發(fā)熱、腹瀉、嘔吐或伴有慢性消耗性疾病者都不宜接受本試驗?！酒胶庠囼灐恳?、原理在機體相對穩(wěn)定的條件下，測定一定時間內(nèi)某物質(zhì)的攝入量和各種排泄物的排出量，以了解該物質(zhì)的攝入和排出的關(guān)系。如測定結(jié)果為攝入小于排出，則該物質(zhì)有丟失，為負平衡；如攝入大于排出，表明該物質(zhì)在體內(nèi)積存，屬正平衡；攝入等于排出，為平衡狀態(tài)。但在實際工作中，由于實驗方法、測定誤差和個體差異等的固有影響及偽差

3、，不能單憑實驗結(jié)果的數(shù)值做出結(jié)論。一般來說，測定方法越粗糙，實驗誤差也越大。個體差異因人而定。群體研究時，可用統(tǒng)計概率公式確定。但由于代謝平衡試驗的方法選擇的對象有限，一般要同時有非相關(guān)群體的對照觀察。如自身對照試驗前后配對研究，則個體差異較小。以往用化學(xué)方法測定尿、糞及食物中的無機鹽或氮含量，由于實驗誤差來源較多，在缺乏對照的條件下，有人主張以5%10%作為實驗誤差基值。也就是說，攝入與排出的物質(zhì)量在總攝入量的5%10%范圍內(nèi)時，可視為總平衡（total balance），即總體水平上的平衡狀態(tài)（balance state）。當(dāng)然，如有對照，可憑統(tǒng)計學(xué)結(jié)果作出結(jié)論。近代的平衡試驗多用穩(wěn)定同位

4、素作標(biāo)記示蹤劑，由于誤差減少，操作環(huán)節(jié)簡化，總平衡的概念應(yīng)從新規(guī)定。二、實驗設(shè)計（一）實驗計劃和對照觀察 一般可分為兩類：用A個體的結(jié)果同B個體進行比較。同一個體在一種處理程序（包括飲食、藥物、生活安排等）與另一種處理程序下的結(jié)果進行比較。因為個體差異性較大，故后一種方法的結(jié)果比較可靠1。（二）實驗期限 取決于研究內(nèi)容。代謝平衡試驗常以34天為一代謝期。代謝期太長，費時，且不利于觀察對象的變化；代謝期太短，則糞便標(biāo)本可能出現(xiàn)較大誤差。如需要，留尿的間隔可以縮短，可分為24小時或48小時，亦可每8或12小時收集標(biāo)本一次。進食實驗膳食數(shù)天后方可收集標(biāo)本，這一時期稱為過渡期或適應(yīng)期。其目的在于使機體

5、在這一特定的條件下達到相對穩(wěn)定狀態(tài)。過渡期的長短可根據(jù)該物質(zhì)在體內(nèi)代謝的時間而定，一般為12天。同一受試對象在接受不同干預(yù)時，需有足夠的間隔期。（三）實驗膳食 根據(jù)研究目的和受試對象的飲食習(xí)慣，由營養(yǎng)師配制實驗膳食。營養(yǎng)師首先要調(diào)查受試者自由飲食時的情況，然后制定食譜。要確保能量供應(yīng)，并注意食物中其它相關(guān)物質(zhì)的含量。試驗前應(yīng)試進食一天，以及時調(diào)整食譜，確保試驗期間受試者能完全攝入所規(guī)定的食物。如有剩余，應(yīng)及時送至實驗室檢查，并從總攝入中減去。由于自來水和天然水中所含礦物質(zhì)濃度較高，所以烹飪和飲用的水都需用蒸餾水。（四）標(biāo)記物的使用 為了保證糞便標(biāo)本收集的準(zhǔn)確性和完整性，常使用腸道不吸收物質(zhì)作為

6、標(biāo)記物?？t（carmine red）口服后大便呈紅色，可在試驗開始和結(jié)束時服用，作為劃分實驗期限的標(biāo)志物?；钚蕴际勾蟊愠屎谏?，亦可使用。此外，還可在每餐進食時加用另一種不吸收的標(biāo)記物，用于校正糞便中該物質(zhì)的含量。常用的有聚乙烯二醇（polyethylenglycol, PEG）、Cr2O3 、CrCl3和51Cr。（五）實驗期間的活動 可進行適當(dāng)?shù)妮p度體力活動。保證體重?zé)o明顯變化。但要注意避免顯性出汗。大汗可增加水、電解質(zhì)和某些物質(zhì)的丟失。（六）糞便和食物標(biāo)本灰化或消化2 可視測定內(nèi)容的需要采用不同方法1干灰化法 通過高溫灼熱使樣本脫水、焦化。在空氣中氧的作用下，使有機物氧化分解成二氧化碳、

7、水和其他氣體揮發(fā)，殘留的無機物供測定用。該方法適用范圍廣，可用于很多微量元素的分析。操作簡便，需要設(shè)備少，灰化過程中不需要人看守，并適合于大批量樣品的處理，省時省事。缺點是由于敞口灰化，溫度高，容易造成待測成分的揮發(fā)損失；其次是某些待測成分吸留于坩堝的孔穴中很難溶出，致使回收率降低。2濕消化法 在樣品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等強酸，加熱破壞有機物。硝酸是強氧化劑，但由于沸點較低，在高溫條件下易擴散，氧化能力不持久。因此當(dāng)消化過程需要補加時，應(yīng)先冷卻。其優(yōu)點是對金屬具有較強的溶解能力，除了金和鉑以外，幾乎能溶解所有的金屬。高氯酸在低溫時沒有氧化能力，但加熱時是一種強氧化劑，其氧化能力強于硝酸和硫

8、酸，可分解所有的有機物，消化速度也快。但需注意，在高溫下，高氯酸直接接觸某些還原能力強的物質(zhì)（如酒精、甘油、糖類、次磷酸及其鹽）時，因反應(yīng)劇烈有發(fā)生爆炸的可能，故一般不單獨使用，并且要避免消化液燒干，以免發(fā)生危險。濃硫酸在加熱條件下具有一定的氧化能力，但不如高氯酸和硝酸，它只能使樣品中的蛋白質(zhì)氧化脫氨，而不會進一步氧化成氮氧化物。濃硫酸對有機物有強烈的脫水作用，并使其炭化。此外，硫酸具有沸點高（338），不易揮發(fā)損失等優(yōu)點。有時還需加入一些氧化劑（如高錳酸鉀、過氧化氫等），以加速樣品的氧化分解，完全破壞樣品中的有機物，使待測的無機成分釋放出來，并形成各種不揮發(fā)的無機化合物，以便作進一步的分析測

9、定。常用的消化方法：硫酸消化法 如用凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量，可用此法來進行消化。由于硫酸的氧化能力較弱，消化液炭化變黑后，保持較長的炭化階段，使消化時間延長?？蛇m當(dāng)加入某些氧化劑。硝酸-高氯酸消化法 可先加硝酸進行消化，待大量有機物分解后，再加入高氯酸。此法反應(yīng)速度快，炭化過程不明顯；消化溫度低，揮發(fā)損失少。但由于兩種酸經(jīng)過加熱都容易揮發(fā)，故當(dāng)溫度過高、時間過長時容易燒干，并可能引起殘余物燃燒或爆炸。硝酸-硫酸消化法 在樣品中加入硝酸和硫酸的混合液，或先加入硫酸。加熱使有機物分解，在消化過程中不斷補加硝酸。此法可縮短炭化過程和消化時間，反應(yīng)速度適中。但因含有硫酸，不宜作堿土金屬的分析。

10、三、實驗步驟（一）試驗膳食 調(diào)查受試者的飲食習(xí)慣，根據(jù)研究目的制定食譜。試進食實驗膳食一天，調(diào)整食譜。進食實驗膳食12天（過渡期）。每餐同時服用PEG 1克。在實驗期第一天及實驗結(jié)束后第一天的早餐前服用卡紅0.3克（裝于膠囊內(nèi)），或服活性炭0.5克。實驗期每餐亦同時服用PEG 1克。（二）尿標(biāo)本的收集 實驗期第一日上午7時令受試者排空膀胱，將尿液棄去，然后收集每日24小時尿液。用濃鹽酸防腐（每100毫升尿液加0.5毫升濃鹽酸）。容器上需注明受試者姓名、實驗日期等，以防混淆。測定每日尿液總量。留取部分尿液，置-20保存待測。（三）糞標(biāo)本的收集和處理 從第一次服用卡紅后大便變?yōu)榧t色起，至第二次服用

11、卡紅后大便出現(xiàn)紅色前，收集所有的大便。每日可用濃鹽酸或20%硫酸20毫升防腐。測脂肪一般用冰醋酸20毫升防腐。糞便標(biāo)本需儲放陰涼處。將全部糞便標(biāo)本移入搗碎機中，加適量蒸餾水，將大便搗成糊狀。如標(biāo)本較多，可分成數(shù)次進行，然后混勻所有標(biāo)本。將糊狀糞便標(biāo)本倒入一帶塞且有刻度的大號容器內(nèi)，視標(biāo)本量的多少稀釋到10003000毫升，用力搖勻。記錄大便總量，留取部分樣品。（四）糞標(biāo)本灰化或消化 主要有兩種方法：干灰化法，首先將大便溶液5毫升冷凍干燥（-18 72小時），然后放入瓷坩堝內(nèi)或白金杯內(nèi)，置于高溫爐中（600 48小時），用濃鹽酸10毫升溶解剩余物，將溶液濾入100毫升帶塞量瓶中，濃鹽酸沖洗濾紙5

12、次。用蒸餾水稀釋至100毫升后待測。濕消化法，取大便溶液5毫升注入凱氏燒瓶，加入適量的消化液，將瓶傾斜呈45°，用電爐加熱瓶的底部，直至消化完全為止。由于有大量消化酸霧和消化分解產(chǎn)物逸出，故需在通風(fēng)櫥內(nèi)進行。也可將樣品和消化液放入硬質(zhì)錐形瓶中，瓶口放一小漏斗，置于電熱板上進行加熱消化。在消化過程中需要補加酸或氧化劑時，首先要停止加熱,待消化液稍冷后沿瓶內(nèi)壁緩緩加入，以免發(fā)生劇烈反應(yīng)，引起噴濺，造成對操作者的危害和樣品的損失。消化完全的樣本應(yīng)為無色液體，冷卻后移入100毫升容量瓶內(nèi)，稀釋至100毫升待測。（五）食品取樣和處理 膳食成分的測定，有兩種方法：一種方法是按照食物成分表計算，另

13、一種方法是直接分析食物的樣品。按照食物成分表計算的結(jié)果，只能供營養(yǎng)師配制膳食時參考之用。不同時間和不同來源的食物成分，可能有相當(dāng)大的差異。計算的結(jié)果與實際分析的結(jié)果往往有較大的差別，所以不能作為分析研究資料的數(shù)據(jù)。準(zhǔn)確的代謝研究必須采用直接分析法。食物的樣品可于配制實驗膳食時另外配制完全相同的一份作為分析用。但全份食物浪費較大，一般可用全份食物的1/3或1/5。標(biāo)本處理方法同前。四、結(jié)果分析標(biāo)本分析后須審查換算步驟，如稀釋倍數(shù)等。尿、糞排除量可用肌酐和標(biāo)記物校正。常用的參數(shù)：平衡值=每日或總攝入量每日或總糞排除量+每日或總尿排除量；腸凈吸收率=每日或總攝入量每日或總糞排除量/ 每日或總攝入量&

14、#215;100% 在解釋結(jié)果時，要考慮實驗本身可能發(fā)生的誤差。個體試驗的正或負平衡值小于攝入總量的10%時，有可能是機體調(diào)節(jié)或試驗誤差所致，不一定具有重要的實際意義。該方法是一種傳統(tǒng)的了解物質(zhì)代謝平衡的方法，曾被廣泛應(yīng)用于各種生理條件下各物質(zhì)需求量和病理條件下某一物質(zhì)代謝的研究36。但它僅能反映整體的正負平衡變化，不能顯示體內(nèi)的代謝途徑和詳細變化，也無法計算內(nèi)生性物質(zhì)。此外，從皮膚、汗液、頭發(fā)等部位丟失的部分無法計算，存在一定的局限?！就凰厥聚櫞x試驗】一、放射性核素示蹤法放射性核素示蹤是利用放射性核素或其標(biāo)記物作為示蹤劑，采用口服或靜脈注射的方法引入體內(nèi)，從體外或取標(biāo)本觀察示蹤物的去向，

15、以了解機體在生理、病理過程中物質(zhì)的吸收、分布、代謝和排泄。放射性核素或其標(biāo)記物的化學(xué)性質(zhì)及生物性質(zhì)與相應(yīng)的非標(biāo)記物的性質(zhì)完全相同，即它們在生物體內(nèi)所發(fā)生的化學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)和生物學(xué)過程都是完全相同的，但卻有不同的物理性質(zhì)，既放射性核素可發(fā)射出射線，通過核測量儀器可對射線進行測量和定量，觀察被放射性核素所標(biāo)記物質(zhì)。用放射性核素研究物質(zhì)代謝的示蹤實驗，除前面平衡實驗設(shè)計中需要考慮的問題外，還包括以下幾個方面。（一）放射性示蹤物的選擇 主要根據(jù)實驗?zāi)康?、實驗周期和測量方式考慮7。1核素的半衰期 所用半衰期過長或過短的核素都不合適。半衰期過短的核素，實驗尚未結(jié)束，其放射性已衰變過多，導(dǎo)致測量困難；使

16、用半衰期太長的核素，則放射性物質(zhì)在機體內(nèi)殘留時間太長，對機體不利。實際工作中除考慮核素的物理半衰期外，還要考慮該示蹤物在體內(nèi)的生物半衰期。有些示蹤物雖然物理半衰期很長，但在體內(nèi)停留時間不長（生物半衰期短），同樣可安全使用。如14C的物理半衰期為5千多年，有利于運輸和保存，但它的生物半衰期只有10多天。因此，應(yīng)根據(jù)實驗周期，同時注意考慮示蹤物的物理半衰期和生物半衰期，即該示蹤物的有效半衰期。2放射性核素射線的類型 一般粒子很少用于生物示蹤實驗。射線穿透力強，發(fā)射此類射線的示蹤物樣品制備和測量都比較簡便，在體外觀察示蹤物于體內(nèi)運動規(guī)律，則必須使用發(fā)射射線的核素標(biāo)記物。發(fā)射射線的核素如3H、14C、

17、32P等大多數(shù)可以進行同位素標(biāo)記（既以放射性原子替代原來非放射性的相同原子），各種代謝轉(zhuǎn)換的研究多選用發(fā)射射線的核素。3足夠的放射化學(xué)純度和比活度 對放射化學(xué)純度的要求是不應(yīng)有放射性雜質(zhì)（包括其他放射性核素及同一核素標(biāo)記的其他化合物或游離的放射性核素），其放射化學(xué)純度應(yīng)在95%以上，放射化學(xué)純度的降低勢必干擾示蹤實驗的測量結(jié)果。由于放射性示蹤劑在體內(nèi)應(yīng)用過程中都會被大量稀釋，并且要求最后制成的樣品必須仍能達到測量要求，則起始應(yīng)用的示蹤物放射性比活度必須較高。如果比活度太低，為了滿足測量要求就需要增加化學(xué)量，導(dǎo)致化學(xué)量過高而引起示蹤實驗結(jié)果失去生理真實性。另一方面，比活度過高，可能引起被標(biāo)記的化

18、合物分子受到輻射損傷，亦影響示蹤結(jié)果。（二）確定合適的示蹤用量 實驗中示蹤用量的確定包括示蹤物的化學(xué)用量和核素的放射性活度?；瘜W(xué)量應(yīng)為示蹤量，即盡可能低或者根據(jù)實驗?zāi)康牡囊笥靡欢ǖ幕瘜W(xué)量。放射性活度的確定原則是：使用的放射性測量手段可以較靈敏地測出最后樣品的放射性，在達到測量結(jié)果準(zhǔn)確的條件下，確定最小的放射性活度。具體應(yīng)用時要考慮不同給予途徑時的標(biāo)記物利用率，其在系統(tǒng)內(nèi)的稀釋程度及分布和廓清特點、實驗周期長短、觀察方法、測量方法及測量效率等，待測樣品所含的放射性活度，為達到測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，最后樣品要求測得的最低計數(shù)率，用反推法估算需引入的放射性活度：根據(jù)被測樣品的最低計數(shù)率要求，并校正在實

19、驗過程中各種影響因素所造成的放射性活度的損失量，計算初始應(yīng)用的示蹤劑量。例如：靜脈注射示蹤物，被觀察的整個組織可攝取該示蹤物的量約占引入總量的1%，擬觀察10天，在此期間示蹤物從該組織中消失約為初始攝入量的90%，擬取待測樣品約為該組織總量的10%，測量最低計數(shù)率要求為250cpm，測量儀器的計數(shù)效率為50%，于是最少放射性dpm=250¸50%=500dpm；取樣時該組織的總dpm：500¸10%=5000dpm；初始時該組織的總dpm：5000¸（1-90%）=5´106dpm；初始應(yīng)引入的示蹤量：5´106¸60=83.3kBq

20、。如果采用口服的方式還要考慮示蹤物的吸收率（由攝入量、吸收效率和示蹤劑通過胃腸的速度等因素決定）。（三）放射衛(wèi)生防護和廢物處理 放射衛(wèi)生防護包括實驗工作人員及實驗對象的防護。輻射損傷需一定的劑量，只有在超過最大允許劑量的照射后才對機體有損害。同時應(yīng)采取必要的防護措施，注意防止不必要的輻射。動物實驗時，除考慮個體動物引入的示蹤量，還必須考慮到放射性核素示蹤實驗與一般理化實驗不同，動物接受了放射性核素，既便對個體動物是安全劑量，但動物同時成為輻射源，動物間可相互照射，動物還要排除放射性物質(zhì)可污染、照射周圍環(huán)境。因此，對動物群體飼養(yǎng)和排泄物的處理應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧?。對操作器具、放射性組織標(biāo)本、動物尸體

21、及其他放射性廢物的處理，應(yīng)根據(jù)具體情況和條件，按照放射衛(wèi)生防護和廢物處理的有關(guān)規(guī)定進行操作處理。（四）實驗方法和步驟 有單標(biāo)和雙標(biāo)二種方法。同位素經(jīng)口服或（和）靜脈注射，然后留取血、尿或糞標(biāo)本，測定標(biāo)本中的同位素量，通過計算了解物質(zhì)的代謝狀況。常用的放射性同位素有15O、13N、14C、45Ca、47Ca、28Mg、65Zn、59Fe、55Fe?，F(xiàn)列舉測定鈣吸收的幾種方法。45Ca釋放射線（半衰期165天），47Ca可釋放和射線（半衰期4.7天）。1單標(biāo)法 受試者隔夜空腹，口服一種放射性同位素5Ci45Ca（20mg 45CaCl溶于250ml蒸餾水），1小時后抽血，離心，采用液閃儀測定血漿中

22、的同位素活性（Fx/L），乘以體重的15%，求得1小時在血漿和細胞外液中的理想量（FC），或用ordin提出的公式：FC=Fx/10L15.4×（1/體重0.0154），然后套入經(jīng)驗公式：每小時吸收率=1.17FC+2.54FC28。 該法簡便、快速，價格低廉。Nordin 等應(yīng)用該技術(shù)在甲旁亢和腎結(jié)石的病人中發(fā)現(xiàn)鈣吸收增加，骨軟化和腎衰病人鈣吸收下降，正常人和骨質(zhì)疏松癥患者鈣吸收與血中降鈣素水平相關(guān)。髖部骨折的婦女鈣吸收低下。用1-羥化維生素D3治療骨質(zhì)疏松后鈣吸收增加。Krall等9采用計算2小時血中45Ca的量/口服總45Ca的量測定鈣吸收率，發(fā)現(xiàn)吸煙可致腸鈣吸收減少。2雙標(biāo)法

23、 較單標(biāo)法更精確和可得到更多的資料。受試者隔夜空腹，在早餐結(jié)束時服用一種同位素，之后靜脈注射另一種同位素，35分鐘內(nèi)注完。在6、12、30、45、60、120、240、480分鐘抽血，留6、12或24小時尿。通過測量血或尿中的二種同位素比確定吸收率。用47Ca和45Ca需要花費的時間較長，約68周。這是由于47Ca和其產(chǎn)物47Sc可干擾45Ca活性的測量，因此，必須待47Ca和47Sc自動減少后，才可確定45Ca活性。為縮短時間，De Grazia等提出同時在標(biāo)準(zhǔn)和樣本中沉淀Ca，保持Sc的比例相同，這樣可只測/率，得出鈣吸收率。有學(xué)者則用85Sr替代45Ca作為靜注示蹤物，而用47Ca口服，

24、因為Sr的血液動力學(xué)在310小時與Ca相同。Griessen等提出先在Sc通道測量47Ca的活性，比上用Ca通道所測活性。計算47Sc和47Ca的比率，得出純47Ca量，然后求得47Ca與45Ca之比10。3核素稀釋法 核素稀釋法是根據(jù)化學(xué)物質(zhì)在被稀釋前后其質(zhì)量不變的原理建立起來的。如:已知放射性活度為S1，質(zhì)量為M1的標(biāo)記物和未知質(zhì)量Mx的同一種化學(xué)形式的非標(biāo)記物充分混勻后，標(biāo)記物被非標(biāo)記物所稀釋，測混合物的放射性比活度S2必然比S1低，但是稀釋前后的放射性總活度相等，即：S1×M1=S2×(M1+M2)。因為混勻后放射性比活度S2保持恒定，不隨取量的多少而變化，測定時只

25、要取出部分樣品做分離定量，測定其比活度，代入公式中求得待測物質(zhì)的質(zhì)量。該方法可以從總的糞便排泄中區(qū)分出來自內(nèi)源性的排泄，計算出物質(zhì)的真實吸收量（率），已應(yīng)用于動物中鈣、鋅、錳、鐵、鈷等元素的生物利用度的研究。該技術(shù)測定鈣的生物利用度的方法11是：首先動物進行飼喂方式和時間的適應(yīng)。肌注適量的45Ca，注射液用生理鹽水稀釋45CaCl2配制而成。用于標(biāo)記機體內(nèi)源性鈣庫，此后出現(xiàn)在糞便中的放射性鈣均為內(nèi)源性鈣。待機體達到平衡后，選擇適當(dāng)?shù)膮⒈冉M織，如血液，測定比活性(45Ca活性/組織中的鈣量)。同時測定糞中45Ca的活性。糞便、飼料、血漿、尿液經(jīng)干灰化法處理后，可用原子吸收光譜法測鈣含量。計算內(nèi)源

26、性糞鈣：內(nèi)源性糞鈣（mg/d）=糞中45Ca的活性（Bq/d）/參比組織的比活性。計算鈣的真實吸收量（率）：真正吸收率(%)=總鈣攝入量- (總糞鈣排泄量-內(nèi)源性糞鈣)×100%/總鈣攝入量放射性核素示蹤法靈敏度高，通?？删_測出10-1410-18g的放射性物質(zhì)，因而對研究微量生物活性物質(zhì)具有特別價值；放射性核素及其標(biāo)記物的用量很少，引入后幾乎不會改變體內(nèi)的正常生理平衡，實驗結(jié)果接近正常生理狀態(tài)；測量方法簡便，不受其他非放射性物質(zhì)的干擾及其他物理和化學(xué)因素的影響，不必對樣品進行復(fù)雜的分離和提純。但應(yīng)用范圍受限；實驗過程中可能存在放射生物效應(yīng)，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性；實驗操作時，對環(huán)境

27、有放射性污染。因此，此法正逐步為穩(wěn)定核素所替代。二、穩(wěn)定核素示蹤法穩(wěn)定核素示蹤技術(shù)在本世紀(jì)二十年代已被應(yīng)用于生命科學(xué)的研究，近十余年來，隨著穩(wěn)定核素生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展以及探測技術(shù)的改進，使穩(wěn)定核素示蹤技術(shù)被廣泛應(yīng)用。由于它不具有放射性，沒有放射生物效應(yīng)，因此對于臨床應(yīng)用方便，適用于兒童、妊娠及哺乳的婦女；標(biāo)記的化合物不會衰變，不會輻射和自動裂解，不需要采取防護措施，實驗不受時間限制。（一）原理 穩(wěn)定核素是同一元素的同位素，具有相同的化學(xué)性質(zhì)，它們在有機體內(nèi)所發(fā)生的化學(xué)變化和生物學(xué)過程完全相同，但與同一種天然元素具有不同的質(zhì)量，故具有可測量性。穩(wěn)定核素標(biāo)記的示蹤劑可以應(yīng)用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS

28、）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、熱離子質(zhì)譜儀（thermal ionization mass spectrometry）、電感偶合質(zhì)譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、高速原子轟擊-繼發(fā)離子質(zhì)譜儀（fast atom bombardment-secondary ion mass spectrometry，F(xiàn)AB-SIMS）、核磁共振光譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMRS）、紅外分光光度法（infrared spectrophotometry）、發(fā)

29、射光譜分析法（emission spectrometric analysis）等測定方法，計算穩(wěn)定同位素豐度，對標(biāo)記物質(zhì)進行定性、定量及定位研究。（二）實驗方法和步驟 近十年來多采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記進行代謝研究。方法和步驟與放射性同位素相似。通過給予一種（口服）或兩種（口服和靜注）穩(wěn)定同位素標(biāo)記的物質(zhì)，測量該物質(zhì)所攜帶的同位素量，了解該物質(zhì)的排泄和體內(nèi)存留量。這一方法提高了試驗的精確性，可了解體內(nèi)代謝過程。常用的穩(wěn)定同位素有：13C、18O、15N、42Ca 、44Ca、46Ca、48Ca、25Mg、26Mg、67Zn、70Zn、58Fe、57Fe。13C呼氣試驗和15N尿試驗是兩種常用的方法7

30、，12，既可用于糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)的代謝研究，又可用于臨床多種代謝疾病的診斷。缺點是所需的試驗條件較高。目前某些物質(zhì)（如錳）還不能找到相應(yīng)的穩(wěn)定同位素。113CO2呼氣試驗 13C標(biāo)記的化合物在體內(nèi)被氧化為13CO2，通過測定一定時間內(nèi)呼氣中13CO2/CO2比值的變化，了解某一化合物在體內(nèi)的代謝過程。它具有方便、無創(chuàng)傷等優(yōu)點，但由于呼氣中的13CO2被體內(nèi)大量的CO2所稀釋，豐度不高，需要靈敏的檢測儀器。步驟如下：受試者應(yīng)禁食12小時，避免對本底13C的影響。試驗日先收集一次呼氣樣品，然后攝入13C-標(biāo)記物。攝入量應(yīng)根據(jù)標(biāo)記物的同位素豐度、標(biāo)記物在體內(nèi)吸收和氧化的速率、分析儀的

31、精度制定。攝入13C-標(biāo)記物后，每間隔1030分鐘收集一次呼氣樣品。純化呼氣樣品。測定結(jié)果。臨床應(yīng)用：13C-葡萄糖診斷糖代謝疾病 可用于診斷兒童糖尿病及藥物治療觀察。1-13C-亮氨酸、1-13C-苯丙氨酸、13C2-甘氨酸研究氨基酸和蛋白質(zhì)的體內(nèi)氧化代謝。13C-乳糖和13C-蔗糖可診斷雙糖吸收不良。13C-碳酸氫鈉用于研究肝臟血漿蛋白的合成13C-醋酸鹽和13C-乙醇了解醛脫氫酶缺乏癥。215N尿試驗 含氮物質(zhì)在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要通過尿排泄,檢測尿液中的15N含量,可了解某一物質(zhì)的代謝過程。這一方法較13C呼氣試驗精確。試驗步驟如下：受試者在實驗前需禁食一夜，實驗前將尿排空，并留尿樣作本

32、底。予以15N-標(biāo)記物，收集一定時間的尿液，20保存。根據(jù)研究的內(nèi)容對尿液進行處理。測量尿液中的15N豐度，計算結(jié)果?！咎谴x的動力學(xué)研究】一、原理一般采用穩(wěn)態(tài)單庫模型。在空腹時，通過恒速注入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的葡萄糖，使血漿中的葡萄糖的同位素豐度出現(xiàn)平臺。這時輸入葡萄糖的速率等于體內(nèi)內(nèi)生葡萄糖的生成率。由于葡萄糖分解后，一部分丙酮酸又可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰Ｒ虼?，示蹤劑的再循環(huán)成為影響計算葡萄糖轉(zhuǎn)換率的因素。采用不同的穩(wěn)定同位素或同一同位素不同標(biāo)記位置，則得到的葡萄糖生成率不同13、14。二、實驗方法和步驟常用6，6-2H-葡萄糖、1-13C和U-13C-葡萄糖。其方法是：示蹤劑溶入無菌等滲鹽水中，用M

33、illipore膜濾過滅菌。受試者禁食過夜，試驗當(dāng)日在空腹?fàn)顟B(tài)下。從一側(cè)肘前靜脈插入導(dǎo)管，用于采集血樣。注入示蹤劑前留取血樣，作為本底。在另一側(cè)前臂靜脈注入示蹤劑。首先予以初始劑量，為持續(xù)注入速率的5090倍，隨后予以持續(xù)恒速靜滴，輸注率：6，6-2H-葡萄糖25µg·kg-1·min-1、1-13C葡萄糖6µg·kg-1·min-1，U-13C-葡萄糖2.5µg·kg-1·min-1。每30分鐘取血，并用麻醉袋收集呼氣。血樣經(jīng)離心后10保存，待測。測量血中的13C豐度。1-13C豐度的測量在真空中用酶脫

34、羧產(chǎn)生CO2，然后用IR-MS（同位素比率-質(zhì)譜法）測13C/12C。結(jié)果計算和分析：血漿葡萄糖生成率RT=示蹤劑的輸入速率（kg-1·min-1）/穩(wěn)態(tài)時血漿葡萄糖的同位素原子百分超由于6，6-2H-葡萄糖和1-13C葡萄糖可再循環(huán)，所以反映的是總的生成率；而U-13C-葡萄糖再循環(huán)的幾率小，可反映真生成率?！酒咸烟茄趸省吭跍y定以上參數(shù)的基礎(chǔ)上，同時收集一定時間的呼氣，用質(zhì)譜儀測量呼氣中的13C豐度。如用U-13C-葡萄糖為示蹤劑，則葡萄糖氧化率=（葡萄糖氧化產(chǎn)生的CO2量的百分比´呼出CO2的mol/kg´0.180）/6。葡萄糖氧化產(chǎn)生的CO2量的百分比=

35、（呼氣中13CO2的原子百分超´100）/（血漿中13C-葡萄糖的原子百分超´C）。C為系數(shù)，一般在0.800.83之間。Reinauer等15用6，6-2H-葡萄糖和U-13C-葡萄糖對男性研究結(jié)果顯示：在穩(wěn)態(tài)條件下，葡萄糖更新率為2.42±0.11mgkg-1min-1,葡萄糖氧化率1.34±0.08 mgkg-1min-1,葡萄糖清除率3.04±0.17 mgkg-1min-1,葡萄糖再循環(huán)24.7%（約0.6 mgkg-1min-1）；在高胰島素濃度下（7080mIU/L）葡萄糖更新率增加300%400%，而肝葡萄糖生成速率受到抑制。目

36、前，應(yīng)用穩(wěn)定同位素除了對生理條件下糖動力學(xué)研究外，也應(yīng)用于各種危重病人糖動力學(xué)變化的研究16。此外，穩(wěn)定同位素也被用于糖異生的研究。近年來，有學(xué)者采用氘標(biāo)記水方法研究禁食對健康人糖異生的影響17?！镜鞍踪|(zhì)代謝的動力學(xué)研究】一、原理蛋白質(zhì)代謝的動力學(xué)模型是將體內(nèi)氨基酸的代謝分為四個組成部分。二個來源：由胃腸道攝入（I）和體內(nèi)組織蛋白分解（B）。二個去向：被降解后由糞、尿排出（E）和合成蛋白質(zhì)（Z）。在穩(wěn)態(tài)情況下，Z+E=B+I=Q，Q為更新率。如果已知Q、I和E，則可計算出蛋白質(zhì)的合成和分解速率。二、實驗方法和步驟常用的示蹤劑有1-13C亮氨酸、15N-甘氨酸和環(huán)-D5苯丙氨酸。現(xiàn)以15N-甘氨

37、酸為例：根據(jù)實驗要求確定飲食中的蛋白質(zhì)量和熱卡量；飲食適應(yīng)和過渡期；實驗當(dāng)日清晨首先留取晨尿30ml，然后口服200mg15N-甘氨酸及大便收集指示劑；留取13天的尿糞標(biāo)本。若以尿銨為末端產(chǎn)物只需留尿12小時；用凱氏定氮法測定食物、尿、糞中的攝入和排出的氮量，測量尿銨和尿素中15N的含量。三、結(jié)果計算計算Q=E´d/e d為15N 的示蹤劑量，e為達到“坪值”時某一末端產(chǎn)物中累計排出的氮量。然后計算B=QI、Z=QE。Arnal等18應(yīng)用此法對老年婦女進食蛋白質(zhì)的方式進行了研究，發(fā)現(xiàn)脈沖式進食蛋白質(zhì)可以增加蛋白質(zhì)的保存?！锯}代謝研究】一、鈣吸收率用穩(wěn)定性同位素對鈣吸收的研究方法同放射

38、性同位素相似。由于不受放射性衰變的影響，可更精確、更簡便的測量血或尿中二種同位素的比值，從而得到鈣吸收率。如僅用一次24小時尿即可了解鈣吸收。其步驟如下：試驗前一日將44Ca（0.5mg/kg）混入第二日早餐需飲用的牛奶中，以便均衡。試驗日上午予以42Ca靜注（0.51.2mg/kg），10分鐘注完。隨后立即予以含44Ca的牛奶口服。留取24小時尿液。測量尿中44Ca和42Ca的含量。計算鈣吸收率：鈣吸收率=尿中44Ca含量/尿中42Ca含量。Yergey等19比較了4種測定鈣吸收的方法：24h法（24小時尿口服標(biāo)記鈣/靜脈標(biāo)記鈣）；Spot法（一次尿標(biāo)本口服標(biāo)記鈣/靜脈標(biāo)記鈣）；Lag法（給

39、藥后4小時口服標(biāo)記鈣/給藥2小時后靜脈標(biāo)記鈣）；Dec法去回旋法（deconvolution method）。結(jié)果顯示24h=0.273±0.124，Dec=0.300±0.101，Spot=0.359±0.179，Lag=0.271±0.103。作者認為24h法和Dec法較為理想。近來Smith等20采用小劑量同位素（133µg43Ca口服，7.7µg46Ca靜注）技術(shù)了解鈣吸收，并用唾液代替血標(biāo)本。二、內(nèi)源性糞鈣測定方法如下：試驗日上午予以42Ca靜注（0.51.2mg·kg-1），10分鐘注完。收集注藥后5日的尿標(biāo)本（

40、8小時一份）及10-14日的糞便。用原子吸收光譜法測定尿、糞中鈣含量。尿糞中穩(wěn)定同位素鈣含量采用熱離子質(zhì)譜儀測量。計算內(nèi)源性糞鈣（Vf），即Vf（mg·kg-1·d-1）=Vu（mg·kg-1·d-1）×（t0靜注的同位素在糞中的量/t0靜注的同位素在尿中的量）。Vu為實驗期每日尿鈣的平均值，t為示蹤劑累計達非漸進值的時間。Abrams等21應(yīng)用此法對5名314歲健康兒童內(nèi)源性糞鈣分泌狀況進行了研究。發(fā)現(xiàn)兒童內(nèi)源性糞鈣（1.4±0.4 mg·kg-1·d-1）與成人相似，明顯低于早產(chǎn)兒（1786mg·kg

41、-1·d-1）。三、鈣的動力學(xué)研究（一）原理 Ca動力學(xué)模型分為區(qū)域模型和非區(qū)域模型圖1-12-1 鈣動力學(xué)的非區(qū)域模型圖1非區(qū)域模型 如Charles22提出的模型，見圖1-12-1。該模型組成以下：擴大的鈣池量M（t），放射性鈣首先進入此處。骨BM（t），被礦化的鈣（m）。腸E（t），經(jīng)過糞延遲時間（t）后被分泌到糞便的鈣。尿（u）。汗液和其他皮膚丟失（d）。2區(qū)域模型 有數(shù)種不同區(qū)域的模型?，F(xiàn)介紹其中的一種三區(qū)域模型23，見圖1-12-2。（二）實驗方法和步驟 主要是：飲食適應(yīng)和過渡期。實驗期第一天予以同位素鈣，留取血標(biāo)本。收集每日的尿糞標(biāo)本。用卡紅作為實驗開始和結(jié)束的標(biāo)記。5

42、1Cr與三餐同服，以校正糞鈣。食物和糞便被消化或灰化。血、尿、糞和食物中的鈣用原子吸收光譜法測定。測定血、尿和糞中的同位素鈣。 圖1-12-2 鈣動力學(xué)的三區(qū)域模型 注：區(qū)域代表體內(nèi)不同轉(zhuǎn)換率的鈣池，區(qū)域間的鈣轉(zhuǎn)移L（I，J）指鈣從區(qū)域J到區(qū)域I，轉(zhuǎn)換率R（I，J）= 鈣轉(zhuǎn)移L（I，J） ×區(qū)域的量M（J）。區(qū)域1代表血液，區(qū)域2為軟組織，區(qū)域3為骨中可互換的鈣，區(qū)域0為骨，飲食攝入鈣（Vi）到區(qū)域7，區(qū)域8和9為胃腸道中的鈣，區(qū)域5為糞鈣，區(qū)域6為尿鈣。鈣在骨的沉積(VO+)用L(0，3)表示，骨吸收后鈣釋放(VO-)用L(1，0)表示，內(nèi)源性糞鈣分泌（Vf）為L(9，1)，尿鈣分

43、泌（Vu）為L（6，1），鈣吸收（Va）用L（1，8）表示。（三）結(jié)果計算 根據(jù)采用的Ca動力學(xué)模型計算各參數(shù)。1采用Charles等提出的模型計算：殘余曲線R1（t）由測量整體47Ca殘余直接得出，殘余曲線R2（t）通過尿、糞中47Ca的分泌及血液特異47Ca活性曲線S（t）計算。皮膚鈣丟失（d）由兩種殘余曲線的差和血液特異活性曲線確定。凈鈣吸收（b）=攝入鈣（D）-糞鈣（F），真鈣吸收（a）=凈鈣吸收+內(nèi)源性糞鈣（e），鈣平衡（B）=攝入鈣-尿鈣-糞鈣-皮膚鈣丟失，內(nèi)源性糞鈣由血液特異47Ca活性曲線和糞47Ca的分泌確定。骨礦化率（m）通過曲線擬合方法測量全身殘余曲線確定。骨吸收率（r）

44、= mB。2采用三區(qū)域模型計算：骨鈣的平衡= VO+VO-=Vi（Vf + Vu），鈣吸收率（）=L（1，8）/ L（1，8）+ L（9，8），可用早餐口服鈣在各組織的量資料確定和全日靜脈鈣和總鈣的不同值確定。區(qū)域1的轉(zhuǎn)換是L（2，1）+ L（6，1）+ L（9，1），區(qū)域2的轉(zhuǎn)換是L（1，2）+ L（3，2），區(qū)域3的轉(zhuǎn)換是L（2，3）+ L（0，3）。根據(jù)資料算出以上各區(qū)域的轉(zhuǎn)運量及區(qū)域1、2、3的量。Charles等聯(lián)合應(yīng)用鈣平衡和示蹤動力學(xué)方法對17名正常成人的鈣代謝進行研究，發(fā)現(xiàn)如每日攝入30mmol鈣，則鈣凈吸收為5mmol。每天血漿中有250mmol鈣被腎臟濾過，245mmol被

45、重吸收，尿鈣丟失為5.5mmol。4.5mmol鈣通過消化液分泌到消化道，8mmol鈣從腸道吸收（包括凈吸收和部分重吸收的消化液鈣），糞鈣為26mmol。皮膚每日丟失1.6mmol的鈣。4.9mmol的鈣被礦化沉積在骨，7.1mmol鈣由骨釋放。由于穩(wěn)定同位素可應(yīng)用于兒童，因此近年來對于不同年齡鈣代謝的動力學(xué)研究有較大的進展。Wastney等23應(yīng)用鈣平衡和二種穩(wěn)定同位素示蹤法比較了青春期女孩和青年婦女的鈣動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)青春期女孩有高鈣吸收、低尿鈣分泌、高骨轉(zhuǎn)換和高鈣存留。這種方法除用于生理條件下鈣代謝的研究，還可用于各種代謝性骨病的研究：骨質(zhì)疏松癥 Heaney等24對15名圍絕經(jīng)婦女的研究顯

46、示，骨轉(zhuǎn)換率增加。Charles等應(yīng)用氟化鈉、鈣劑和維生素D2治療20名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女發(fā)現(xiàn)可增加鈣吸收，導(dǎo)致正鈣平衡，骨吸收率下降，骨形成率增加。甲狀腺疾病 Charles等對6名甲亢病人研究顯示鈣吸收減少，尿鈣分泌增加，呈負鈣平衡。骨轉(zhuǎn)換率增加。原發(fā)性甲旁亢 Charles等亦應(yīng)用這一方法對13名原發(fā)性甲旁亢患者鈣代謝進行了研究，顯示骨轉(zhuǎn)換增加。將鈣平衡和同位素示蹤結(jié)合起來研究鈣代謝的方法，可得到鈣在腸道中的絕對吸收量、內(nèi)源性糞鈣量、整體骨骼的骨礦化和骨吸收率、個體準(zhǔn)確的鈣平衡、皮膚鈣丟失。對臨床疾病的研究具有重要意義。但這一方法亦存在一定不足。該法步驟繁瑣，價格昂貴，需要較復(fù)雜的計算。

47、標(biāo)本不易準(zhǔn)確收集（特別是糞便）。所確定的礦化沉積率不是骨基質(zhì)的形成率。將全身骨骼作為一整體研究，對局部骨骼變化（如Paget骨?。﹦t無法應(yīng)用。此外，穩(wěn)定同位素尚可應(yīng)用于體內(nèi)核酸代謝25、皮質(zhì)醇產(chǎn)生率26、尿素生成27和總能量消耗28等多種物質(zhì)代謝研究。目前一些非同位素示蹤劑如生物素、熒光物質(zhì)也用于物質(zhì)代謝的研究。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，人們必將對各種物質(zhì)的代謝有著更深入的認識?！緟⒖嘉墨I】1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院首都醫(yī)院主編. 水與電解質(zhì)平衡. 第二版. 北京：人民衛(wèi)生出版社 1974; 502-508.2. 李影林 主編. 中華醫(yī)學(xué)檢驗全書. 第一版. 北京：人民衛(wèi)生出版社 1996; 25

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