土壤微生物測定指標(biāo)的分析方法和適用范圍

1、土壤微生物監(jiān)測常規(guī)測定指標(biāo)的分析方法和適用范圍分析項(xiàng)目名稱分析項(xiàng)目代碼分析方法代碼分析方法名稱是否推薦分析方法引用標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)適用范圍壤微生物生物量的測定氯仿熏蒸培養(yǎng)法FI土壤微生物研究原理與方法P73-74土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P228-230微生物生物量,碳、氮、磷、硫氯仿熏蒸浸提法FEISO14240-2陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測標(biāo)準(zhǔn)P230-233土壤微生物研究原理與方法P74-81土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P231-233陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測數(shù)據(jù)質(zhì)量保證與質(zhì)量限制P120-122微生物生物量,碳、氮、磷、硫基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸法SIRISO14240-1土壤微生物研究原理與方法P81-82土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析

2、方法P233-234微生物生物量三磷酸腺昔ATP法土壤微生物研究原理與方法P82-84土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P235-236微生物生物量土壤麥角番醇分析法土壤微生物研究原理與方法P84-85真菌生物量土壤幾丁質(zhì)分析法土壤微生物研究原理與方法P85-86真菌生物量土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析平板計(jì)數(shù)法GB/T14643.2GB/T14643.4陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測標(biāo)準(zhǔn)P235-240磷脂脂肪酸法(phospholipidfattyacid,PLFA)LechevalierM.P.,1977陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測標(biāo)準(zhǔn)P240-244陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測數(shù)據(jù)質(zhì)量保證與質(zhì)量限制P122-124土壤微生物研究原

3、理與方法P141-142土壤微生物功能多樣性分析BIOLOG碳素利用法BIOLOG公司1989土壤微生物研究原理與方法P170-171功能基因組學(xué)分析土壤微生物研究原理與方法P171-172土壤微生物功能多樣性分析血指紋法土壤微生物研究原理與方法P173-174脂肪酸譜圖法-磷脂脂肪酸分析法PLFA土壤微生物研究原理與方法P174-178土壤總DNA提取法Bourrain法土壤微生物研究原理與方法P179-182Martin-Laurent法土壤微生物研究原理與方法P179-182Tiedje法土壤微生物研究原理與方法P179-182Janssen法土壤微生物研究原理與方法P179-182Re

4、ddy法土壤微生物研究原理與方法P179-182土壤總RNA提取法Felske法土壤微生物研究原理與方法P182-184Fleming法土壤微生物研究原理與方法P182-184Chang法土壤微生物研究原理與方法P182-184Burgmann法土壤微生物研究原理與方法P182-184土壤微生物遺傳多樣性分析基于雜交熒光原位雜交技術(shù)FISH土壤微生物研究原理與方法P185-189肽核酸探針雜交技術(shù)PNA土壤微生物研究原理與方法P189-190限制性片段長度多態(tài)性分析RFLP土壤微生物研究原理與方法P190-192陸地生態(tài)系統(tǒng)生物觀測數(shù)據(jù)質(zhì)量保證與質(zhì)量限制P125-127土壤微生物遺傳多樣性分析

5、基于PCR克隆文庫法土壤微生物研究原理與方法P192-204變性梯度凝膠電泳DGGE土壤微生物研究原理與方法P192-201,204-208單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析SSCP土壤微生物研究原理與方法P192-201,208-210核糖體基因間區(qū)分析RISA土壤微生物研究原理與方法P192-201,210-211隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析RAPD土壤微生物研究原理與方法P192-201,211-213擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)土壤微生物研究原理與方法P192-201,213-215末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP)土壤微生物研究原理與方法P192-201,215-217土壤呼吸作用密閉靜止培養(yǎng)

6、法GB/T27855土壤微生物研究原理與方法P218-220土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P239-240通氣培養(yǎng)法土壤微生物研究原理與方法P220氣相色譜法土壤微生物研究原理與方法P221纖維素分解埋布片法土壤微生物研究原理與方法P221-222尼龍袋法土壤微生物研究原理與方法P222土壤產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基-氣相色譜土壤微生物研究原理與方法P222-223土壤氨化作用土壤培養(yǎng)法GB/T27854土壤微生物研究原理與方法P223-224土壤懸液法土壤微生物研究原理與方法P224-225土壤氮素凈礦化作用差減法土壤微生物研究原理與方法P225土壤氮素總礦化作用15N稀釋法土壤微生物研究原理與方法P225-226

7、土壤硝化作用土壤培養(yǎng)法GB/T27854土壤微生物研究原理與方法P227-228土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P260-261凈硝化作用土壤懸液法土壤微生物研究原理與方法P228-229土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P261-262凈硝化作用純菌培養(yǎng)法土壤微生物研究原理與方法P229凈硝化作用15n稀釋法土壤微生物研究原理與方法P229-230總硝化作用土壤反硝化作用硝酸鹽消失法土壤微生物研究原理與方法P231-232乙快抑制法土壤微生物研究原理與方法P232-233土壤固氮作用土壤培養(yǎng)法土壤微生物研究原理與方法P233-234土壤懸液法土壤微生物研究原理與方法P234-235乙快復(fù)原法土壤微生物研究原理與方法P

8、235-236土壤磷轉(zhuǎn)化作用土壤培養(yǎng)法土壤微生物研究原理與方法P236-238淹水土壤鐵復(fù)原活性比色法土壤微生物研究原理與方法P239-240環(huán)流土壤中鐵氧化性測定環(huán)流裝置土壤微生物研究原理與方法P240氧化復(fù)原酶活性脫氫酶ISO23753-1ISO23753-2土壤微生物研究原理與方法P245-246過氧化氫酶土壤微生物研究原理與方法P246-247硝酸復(fù)原酶土壤微生物研究原理與方法P247-248多酚氧化酶土壤微生物研究原理與方法P248-249水解酶活性轉(zhuǎn)化酶土壤微生物研究原理與方法P249-250月尿酶土壤微生物研究原理與方法P250-251土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P249-252磷酸酶土

9、壤微生物研究原理與方法P251-253土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P252-254纖維素酶土壤微生物研究原理與方法P253-254蛋白酶土壤微生物研究原理與方法P254-255脂肪酶土壤微生物研究原理與方法P255-256酰胺酶土壤微生物研究原理與方法P256-257L-天冬氨酸酶土壤微生物研究原理與方法P257-259B-葡萄糖甘酶土壤微生物研究原理與方法P259-260幾丁質(zhì)酶土壤微生物研究原理與方法P260-261芳基硫酸酯酶土壤微生物研究原理與方法P261-262土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P254-255轉(zhuǎn)移酶和裂解酶活性果聚糖蔗糖酶土壤微生物研究原理與方法P262-263L-組氨酸氨裂解酶土壤微生

10、物研究原理與方法P263-265土壤呼吸的田問原位測定裝置封閉式動態(tài)氣室法CDC土壤微生物研究原理與方法P291開放式動態(tài)氣室法ODC土壤微生物研究原理與方法P291-292封閉式靜態(tài)氣室法CSCLY/T1220土壤微生物研究原理與方法P292-293土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法P240-241微氣象法土壤微生物研究原理與方法P293-294土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)速率碳穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)土壤微生物研究原理與方法P295-297微生物的氮同位素分儲效應(yīng)氮穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)土壤微生物研究原理與方法P297-299穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)穩(wěn)定同位素核酸DNA探針技術(shù)DNA-SIP土壤微生物研究原理與方法P300-31

11、4穩(wěn)定同位素核酸RNA探針技術(shù)RNA-SIP土壤微生物研究原理與方法P300-304,314-321其他方法：一、土壤DNA提取和純化：方案1,參考1,21 .稱取樣品土樣5g,參加滅菌的石英砂,液氮研磨;不要液氮研磨,這樣子對DNA傷害很大,幾乎全部片段化了.可以加上PBS洗滌下土壤,一是能夠去除些雜質(zhì),二是能夠使得土壤處于懸浮狀態(tài),然后可以在渦旋儀上劇烈渦旋23min,使得土壤顆粒破碎.然后12000rpm離心5min,棄上清.2 .參加13.5mL的DNA提取Buffer,100微升20mg/mL蛋白酶K,37c225rpm搖30min-2h3 .參加700微升20%SDS,65c水浴2

12、h,間隔15min顛倒搖勻數(shù)次；4 .6000rpm室溫離心15min,收集中間液相層；向沉淀中參加3mLDNA提取液,300微升20%SDS,65c水浴30min,同上離心,收集中間液相層,合并；重復(fù)一次；可考慮再增加抽提一次.或者用5mL而不是3mLo最后實(shí)在裝不下了可以分在兩個50mL離心管里面離心.5 .向收集的液相層中參加等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提一次,8000rpm離心10min,收集上部液相層；6 .第5步收集液相層中參加0.1倍體積的乙酸鈉,0.6倍體積的異丙醇,4c過夜沉淀；這個千萬不要4度過夜啊,四度過夜你會發(fā)現(xiàn)很多的絮狀懸浮物,我之前犯過類似錯誤,這個是SDS和高

13、濃度的鹽在低溫條件下析出來了.室溫放置1-2h就好.7 .過夜沉淀物12000rpm離心15min,棄上清；向沉淀中參加10mL冷乙醇洗滌,12000rpm離心5min,棄上清；12000rpm離心30sec,移液槍析出殘留液體；8 .室溫自然枯燥沉淀,枯燥后向沉淀中參加400微升TE溶解.方案2:購置DNA提取試劑盒,如SoilMasterDNAExtractionKit(Epicenter)或UltraCleanSoilDNAIsolationKit(MOBIO)二、DNA定量和質(zhì)量檢測：提取后的DNA使用紫外分光光度法進(jìn)行濃度和純度檢測.DNA純度以O(shè)D260/OD280比值來反映.當(dāng)O

14、D60/OD80比值1.8時,說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì),可采用平衡酚/氯仿/異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醛抽提去除殘留酚,再用無水乙醇沉淀,TE懸浮后再測定.當(dāng)OD60/OD280比值2.0,說明樣品存在RNA污染,可以用RNA酶處理樣品去處RNAo和定量,應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA大小及完整度.三、土壤宏基因組測序?qū)①|(zhì)檢合格的土壤DNA隨機(jī)打斷,加接頭序列構(gòu)建測序文庫,利用Roche454或IlluminaHiseq系統(tǒng)進(jìn)行測序反響.四、生物信息分析：1 .原始數(shù)據(jù)整理、過濾及質(zhì)量評估：應(yīng)用中科院青能所自主開發(fā)的質(zhì)量限制軟件QC-Chain進(jìn)行原始測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量限制,去除低質(zhì)量堿基

15、和read,并進(jìn)行污染序列的監(jiān)控).IDBA-UD(4),MetaGeneMark(5)等.2 .宏基因組拼接和基因預(yù)測：應(yīng)用基于宏基因組數(shù)據(jù)聚類算法的拼接工具,進(jìn)行宏基因組拼接和基因預(yù)測,如3 .群落可視化分析：包括Parallel-META2.0、MetaSee、Meta-Storm以及Meta-Mesh等工具,具有群落樣本分析,群落樣本可視化分析,群落樣本比擬以及群落樣本搜索和數(shù)據(jù)挖掘等功能.4 .基因功能分析：* 基因功能注釋* 基因功能豐度差異分析* 豐度差異的基因GO富集分析,豐度差異的基因KEGG富集分析* 聚類分析熱圖* 多元統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基于物種豐度分析：* 稀釋曲線+

16、Alpha多樣性分析* 物種豐度差異分析* 聚類分析熱圖* 多元統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基于群落結(jié)構(gòu)分析：* 單樣品物種分布* 多樣品物種分布1. ZhouJ,BrunsMA,TiedjeJM.DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition.Appliedandenvironmentalmicrobiology.1996;62(2):316-22.2. JacksonCR,HarperJP,WilloughbyD,RodenEE,ChurchillPF.Asimple,efficientmethodfortheseparationofhumicsubstancesandDNAfromenvironmentalsamples.Appliedandenvironmentalmicrobiology.1997;63(12):4993-5.3. ZhouQ,SuX,WangA,XuJ,NingK.QC-Chain:FastandHolisticQualityControlMethodforNext-GenerationSequencingData.PloSone.2021;8(4):e60234.4. Peng