生物藥物分析VIP

1、生物藥物分析復習第一章 緒論藥物分析的性質：應用化學，物理化學和生物化學的方法和技術對藥物的質量進行全面控制的學科。藥物分析的任務：藥物研制過程中的“眼睛”；制定藥物質量標準；生產(chǎn)過程中的質量控制；開展臨床藥學研究；常規(guī)藥品的檢驗。*藥品質量標準： 國家對藥品質量及檢驗方法所做的技術規(guī)定。是藥品生產(chǎn)，經(jīng)營，使用以及檢驗和監(jiān)督管理部門共同遵循的法律依據(jù)。*中國藥典的內容：凡例，正文，附錄，索引。藥檢工作基本程序：取樣，鑒定，檢查，含量測定，書寫檢查報告。酶法分析（終點法，酶循環(huán)放大分析法，速度法） 是利用酶作為工具對特定物質（底物、輔酶、抑制劑和激動劑等） 進行定量分析的方法。終點法(總變量法

2、) 測定原理：先借助酶反應（單個酶反應或幾種酶構成的偶聯(lián)酶反應）使被測物定量的進行轉變，然后在轉變完成后，測定底物，產(chǎn)物或輔酶物質的變化量，因此稱為終點法。終點法的條件： 1.必須有專一地作用該被測物質的酶，并能得到它的制品；2 能夠確定使這種酶反應接近進行完全的條件；3.反應中底物的減少或產(chǎn)物的增加或輔酶物質的改變等可以借助某種簡單的方法進行測定；4.在能滿足這些條件的情況下，最好是采用單一酶反應就能進行定量檢測。使用終點法測定應注意的問題 ：酶的底物的專一性（最好是絕對專一性）；反應的平衡；反應液中的酶量；反應產(chǎn)物的抑制。終點法的種類（一）單酶反應定量法：1、底物減少量的測定：胞嘧啶（28

3、0nm ）、腺嘌呤（280nm ）和尿酸（293nm 或 297nm ）。2.產(chǎn)物增加量的測定：（1）各種氨基酸和草酸（2）黃嘌呤、次黃嘌呤以及 CoA* 3.輔酶變化量的測定（理解例子 學會如何進行實驗設計和分析）條件：測定以 NAD或 NADP為輔酶的脫氫酶的底物的量。原理：NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征最大吸收峰，而 NAD 和 NADP 在 340nm 卻無這一吸收帶，故可應用于NAD 或 NADP 為輔酶的脫氫酶反應，通過測定 340nm 吸光度的變化，就可以對作用相應脫氫酶底物的物質進行定量分析。（二）和指示酶反應偶聯(lián)的定量法1. 以脫氫酶為指示劑（理解例子 學會

4、如何進行實驗設計和分析）2. 以脫氫酶以外的酶作為指示劑酶循環(huán)放大分析法具有化學放大作用，理論上可無限放大其靈敏度。是利用酶循環(huán)設計的一種超微分分析法。步驟：轉換反應，循環(huán)反應，指示反應轉換反應 ： 以試樣中的待測組分為底物，經(jīng)特異反應生成與待測組分相當?shù)亩垦h(huán)底物。循環(huán)反應 ：生成的循環(huán)底物反復參加由兩個酶反應組成的偶聯(lián)反應，所得產(chǎn)物量為循環(huán)底物的若干倍。指示反應 ：采用酶法測定反應產(chǎn)物。由反應產(chǎn)物量及循環(huán)次數(shù)，計算出循環(huán)底物量，再推算出試樣中待測組分的量。酶循環(huán)放大分析法應用范圍1. 有循環(huán)底物參加的酶反應的底物或酶可測定(NAD 、NADP 、CoA)2. 能與以上反應偶聯(lián)的酶反應的底

5、物或酶可測定（GATPHK ） 酶循環(huán)放大分析應該注意的問題:1. 在進行循環(huán)之前，必須完全除去轉換反應中剩余的輔酶；2. 在循環(huán)反應中底物（不是輔酶）必須過量；3. 要用已知量的循環(huán)底物做循環(huán)反應和指示反應以求得循免疫分析利用抗原抗體反應檢測各種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的方法?？乖c抗體性質 及其相互作用免疫球蛋白分子由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過不同數(shù)目的二硫鍵結成Y 形。在抗體分子的N 端為“多變區(qū)”（V 區(qū)），是抗體分子與抗原決定簇的結合部位；抗體分子的 C 端為“穩(wěn)定區(qū)”（C 區(qū)），是抗體抗原特異性部位。 抗原抗體結合具有 高度特異性 ?？乖奶禺愋匀Q于抗

6、原決定簇的數(shù)目、性質和空間構型，而抗體的特異性則取決于抗體 Ig Fab段的可變區(qū)與相應抗原決定簇的結合能力?？乖c抗體通過很弱的短矩引力而結合，如 范德華引力、靜電引力、氫鍵及疏水性作用等。免疫擴散技術10第 27 頁共 16 頁基本原理 ：可溶性的抗原和相應的抗體在溶液或凝膠中彼此接觸，形成不溶性抗原-抗體復合物沉淀。雙向免疫擴散基本原理 ：指可溶性抗原與相應抗體在瓊脂介質中相互擴散，彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。如果反應體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。雙向免疫擴散的 應用 ：1.抗原、抗體相對含量測定；2.抗原、抗體相對分子量分析酶免疫分析技術基本

7、原理 ：指酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應。它采 用抗原與抗體的特異反應與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA） ：結合在固相載體上的抗原（抗體）與待檢抗體（抗原）酶偶聯(lián)物（標記物）反應后， 催化水解或氧化還原酶的相應底物呈色，其顏色深淺與待測抗原（抗體）含量成正比。包被 ：指將抗原或抗體固相化的過程。它是通過物理吸附作用，一般靠疏水鍵連接。封閉：指用封閉劑封閉經(jīng)包被的固相載體表面殘留的未飽和位吸附位點的過程。常規(guī)使用的 ELISA 技術主要有：直接 ELISA ：測抗原間接 ELISA ：測抗體夾心 ELISA ：測抗原競爭 ELISA

8、：測抗體或抗原及半抗原反向捕捉 ELISA ：測特異性 IgM單位點非競爭 ELISA ：主要測半抗原細胞 ELISA ：測細胞表面抗原夾心 ELISA基本原理 ：樣品中抗原與載體上抗體結合，經(jīng)洗滌加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，可定量測定抗原。雙抗體夾心法測抗原 ：應用針對抗原兩個不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體包被和酶標抗體，以檢測相應的抗原。此法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原。雙抗原夾心法測抗體 ：用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法適用于多價大分子抗原（血清中 HBsAg 、A

9、FP 和尿液 hCG ）的檢測，而不能用于測定半抗原等小分子物質。競爭 ELISA競爭法測抗體 ：待測抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。競爭法測抗原 ：待測抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，結果如待測抗原含量越多，與固相抗體結合的酶標抗原就越少，顯色越淺，二者呈負相關。放射免疫測定 RAI 基本原理：放射性標記的已知抗原（*Ag ）和非標記的待檢抗原（Ag ）同時與限量的特異性抗體進行競爭結合或競爭性抑制反應，通過測定結合（ *Ag-Ab）的或游離（ *Ag ）的放射性標記抗原的量，根據(jù)標準曲線

10、即可推算出被測物含量的一種超微量分析技術。免疫放射分析（ IRMA）基本原理：用過量的核素標記抗體與待測抗原形成復合物，并用固相免疫吸附劑作為B 或 F 的分離手段除去多余的游離抗體，測量抗原抗體復合物的放射性。放射免疫與免疫放射原理的區(qū)別IRMA與 RIA 的工作原理的主要區(qū)別項目反應機制反應試劑分離方法待測抗原復合物放射性非特異性結合待檢抗原性質ELISA 操作要點：RIA （放射免疫） 競爭性反應三種標記抗原抗原只需一個抗原決定簇與待測抗原呈負相關主要影響高劑量反應半抗原及大分子IRMA （免疫放射）非競爭性全量反應靈敏度提高（10-100 倍）二種標記抗體一般需單抗作分離劑，抗原需兩個

11、或兩個以上決定簇與待測抗原呈正相關主要影響低劑量反應蛋白質、酶等生物大分子加樣 ：即加標本、酶結合物和底物，注意交叉污染和產(chǎn)生氣泡。溫育 ：常采用的溫度：43、37、室溫和 4（冰箱溫度）。洗滌 ：是 ELISA 最主要的關鍵技術，目的是分離游離的和結合的酶標記物。洗滌方式自動板機、手工操作（浸泡式和流水沖洗式）。顯色 ：影響因素：反應溫度和時間；OPD底物液應避光顯色，硫酸終止；TMB顯色終止液：疊氮鈉、SDS 、各類酸性終止液。比色 ：以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔）。*生物檢定 是利用生物體包括整體動物、離體組織/

12、器官、細胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設計在一定條件下比較 供試品 和相當?shù)?標準品 或 對照品所產(chǎn)生的特定反應，通過等反應劑量間比例的運算或限值劑量引起的生物反應程度，從而測定供試品的效價、生物活 性或雜質引起的毒性。生物檢定的作用：生物檢定法具有獨到的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在： (1)直接關切生化藥物的有效性和安全性；(2) 量效關系確切，可為臨床用藥劑量的規(guī)范化提供參考；(3) 是反映產(chǎn)品質量的重要指標，具有專屬性。生物檢定在藥物分析中的應用 ：1、藥物的效價測定；2、大分子結構的測定；3、微量生理活性物質的測定；4、藥物的毒性

13、成分及有害雜質的限度檢查；5、新藥研究。電泳技術的基本原理電泳：帶電粒子在電場中的定向移動。在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象， 稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。電泳法:指帶電微粒如蛋白質、核苷酸、其他微粒分子或離子在電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度泳動而使組分分離，再進行檢測或計算百分含量的方法。顆粒在溶液中遷移的 驅動力 ：顆粒的有效電荷和電位梯度。影響電泳速度的 因素 ：顆粒性質；電場強度；溶液性質；電滲；焦耳熱；篩孔:聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺

14、凝膠為支持物，采用電泳基質的不連續(xù)體系（即凝膠層、緩沖液離子成分、PH 、電位梯度均不連續(xù)），使樣品在不連續(xù)的兩層凝膠之間積聚濃縮成很窄的樣品區(qū)帶（厚度為 0.1毫米），然后再進行分離，從而提高了分辨率。PAGE不連續(xù)系統(tǒng)的原理與技術不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種物理效應 ：樣品的濃縮效應 ; 分子篩效應 ; 電荷效應。樣品的濃縮效應:凝膠孔徑不連續(xù)性 緩沖液離子成份的不連續(xù)性 PH 的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性*三種物理效率使樣品分離效果好，分辨率高。一般電泳分離的電荷效應：帶電多，MW小，遷移快不連續(xù)系統(tǒng)對樣品的濃縮效應：遷移率，被壓成薄層凝膠對樣品分子的篩選效應影響蛋白質與 SDS 的結

15、合程度的因素：溶液中 SDS 單體的濃度；樣品緩沖液的離子強度；二硫鍵是否完全被還原SDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理和技術十二烷基硫酸鈉（SDS ）是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質SDS 復合物。蛋白質帶上相同密度的負電荷；SDS 與蛋白質結合后，還引起了蛋白質構象的改變；凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只與蛋白質分子量相關。蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它 的分子量大小，而與所帶電荷和形狀無關。影響遷移率的因素：二硫鍵是否完全被還原；溶液中 SDS 的濃度；溶液的離子強度等電聚焦電泳(IEFE)是一種利用具有

16、 pH 梯度 的支持介質分離 等點電不同 的蛋白質的電泳技術。等電聚焦 就是在電泳介質中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的 pH 梯度，在此體系中，不同的蛋白質即移動到或聚焦于其相當?shù)牡入婞c位置上，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中。*理想的載體兩性電解質應具備的特征：分子量要小，以便與被分離大分子物質分離；化學性質穩(wěn)定；各成分的 pI 彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；在 pI 處具有足夠的電導，導電性均勻；兩性電解質載體的數(shù)目要足夠多；可溶性好；對 280nm 的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。高效毛細管電泳 HPCE ：是

17、以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，根據(jù)樣品各組分之間遷移率和分配行為的差異，而實現(xiàn)分離的一種新型電泳技術。雙向電泳 ：將樣品進行電泳后，為了不同的目的在它的垂直方向再進行一次電泳的方法。雙向電泳的種類：第一向等電聚焦，第二向 SDS 電泳第一向 SDS 電泳，第二向等電聚焦。常用的雙向電泳為第一向等電聚焦，第二向 SDS 電泳。1. 抗原與抗體通過很弱的短矩引力而結合，如_范德華引力_、_靜電引力 、_氫鍵_及 疏水性作用 等。2. 免疫分析法利用_ 抗原抗體 反應檢測各種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的方法。3. RIA 是以放射性核素標記抗原，使標本中 非標記抗原與試劑中

18、標記抗原競爭結合抗體，通過測定結合相的放射性強度，推定標本含量。4. 免疫印跡技術指的是將凝膠電泳與固相免疫測定結合，先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術測定 。5. *標準品 是指用于生物檢定、抗生素或生物藥品中含量或效價測定的標準物質，以效價單位(U)表示。6. 聚丙烯酰胺凝膠制備時，聚合反應所使用的化學催化劑是 過硫酸銨TEMED 光聚合催化劑是 核黃素 。7. 帶電粒子在電場中的移動速度主要決定于 顆粒性質電場強度 和 溶液性質。8. 蛋白質分子在 pH 高于其等電點的緩沖溶液中帶 負 電，在電場中向 正 極移動。色譜分析按操作形式分類:紙色譜,薄層色譜,柱色

19、譜.紙色譜 ：以紙為載體,紙上所含水分或其他物質為固定相,用展開劑進行展開的分配色譜.紙色譜的影響因素 ：1 濾紙的影響 2 展開劑的影響 3 物質極性的影響 4 pH 的影響 5 溫度和時間的影響薄層色譜選擇吸附劑的原則（1） 樣品組分的性質（2） 吸附劑的性質根據(jù)薄層色譜的分離機制，選擇適宜活性的吸附劑。吸附劑對樣品的作用：薄層的顯色方法不同，所用的吸附劑也不同。吸附劑的規(guī)格對展開劑的要求(1) 能夠溶解待測組分；(2) 能使待測組分與雜質分開；(3) 使待測組分的 Rf 值在 0.2-0.8之間；(4) 不能與待測組分或吸附劑發(fā)生化學反應 ； (5)具有適中的沸點和比較小的粘度；(6)展

20、開后組分的斑點圓且集中； (7)混合溶劑最好臨用前新鮮配制薄層色譜法常見的問題和消除的方法：(一)斑點拖尾現(xiàn)象(二)邊緣效應(三)S 形及波浪形斑點(四)斑點呈念珠狀(五)展速慢(六) Rf值不穩(wěn)定N = 16 (tr / w)2 = 5.54 (tr / w1/2)2 HETP=A+B/v+Cv分子篩的優(yōu)缺點？1. 凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。2. 分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近 100。3. 分離條件緩和。4. 應用廣泛。適用于各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬。5. 分辨率不高，分離操作較慢

21、。對于分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現(xiàn)象 。檢測器的類型 ： 紫外檢測器；熒光檢測器；示差折光檢測器；蒸發(fā)光散射檢測器；質譜檢測器；電導檢測器；PH 檢測器。蒸發(fā)散射質量檢測器的優(yōu)缺點：1 與示差折光檢測器相比：靈敏度高; 對流動相系統(tǒng)溫度變化不敏感 ; 可進行梯度洗脫.2 與光吸收檢測器相比：能解決最困難的 HPLC 檢測問題。如磷脂、皂甙、糖類、聚合物、樹脂等無紫外吸收或紫外吸收系數(shù)很小的化合物的檢測 ; 減低流動相溶劑的純度要求; 無需測定定量校正因子.親和色譜也稱為 親和層析，是一種利用固定相 的結合特性來分離分子

22、的色譜方 法。原理：將一對能可逆結合和解離生物分子 的一方最為配基（也稱 為配體），與具有大 孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián) 、制成專一的親和吸附劑 ，再用此親和吸附劑填充 色譜柱，當含有被分 離物質的混合物隨著流動相流經(jīng)色譜柱時 ，親和吸附劑上的配基就有 選擇地吸附能與其結合的物質 ，而其他的蛋白質及 雜質不被吸附，從色譜柱中流出，使 用適當?shù)木彌_液使被分離物質與 配基解吸附，即可獲得純化的 目的產(chǎn)物。高效液相色譜基本儀器裝置： 輸液系統(tǒng)，進樣系 統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)，數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng)。容量因子：是指 在分配“平衡”后，組分在固 定相中的質量與在流動相中質量 的比值。也稱為質量分配系數(shù)。拖尾因

23、子：T=W0.05h/2A 。0.95-1.05之間為對稱峰，小于 0.95為前延峰，大于 1.05為拖尾峰。質譜分析法(mass spectrometry)將: 分和結構分析的一種分析方法?；衔镄纬呻x子和碎片離子，按其質荷比(/值)的不同進行分離測定，來進行成蛋白質質譜:是通過電離源將蛋白質分子轉化為氣相離子，然后利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(/值)的蛋白質離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的/值，分析鑒定已知或未知蛋白質。質譜儀至少由以下四部分組成：進樣系統(tǒng)按電離方式的需要，將樣品送入離子源的適當部位；離子源用來使樣品分子電離生成離子，并使生成的離

24、子會聚成有一定能量和幾何形狀的離子束；質量分析器利用電磁場（包括磁場、磁場和電場的組合、高頻電場和高頻脈沖電場等）的作用將來自離子源的離子束中不同質荷比的離子按空間位置，時間先后或運動軌道穩(wěn)定與否等形式進行分離；檢測器用來接受、檢測和記錄被分離后的離子信號。離子源的功能 是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此， 對于不同的分子應選擇不同的離解方法。硬電離方法能給樣品較大能量的電離方法軟電離方法給樣品較小能量的電離方法，該方法適用于不穩(wěn)定或易電離的樣品。電噴霧離子化技術（electrospray ionizati，onESI）利用強靜電場從溶液直

25、接產(chǎn)生氣態(tài)離子化分子的電離方式。ESI 可以與液相色譜、高效液相色譜、毛細管 IEF 以及毛細管電泳等多種進樣器聯(lián)用。ESI-MS 特點優(yōu)點：解決了極性大、熱不穩(wěn)定的蛋白質與多肽分子的離子化和大分子質量、一級結構和共價修飾位點的測定問題， 并可用于研究 DNA 與藥物、金屬離子、蛋白質和抗原與抗體的相互作用。缺點：樣品中的鹽類對樣品結果影響很大，而且單個分子帶電荷不同可形成多種離子分子峰（重疊峰），所以對混合物的圖譜解析比較困難。基質輔助激光解析電離(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發(fā)光團的化學

26、基質(matrix混) 合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersourc。e)激光作用于樣品混合物，使化學基質吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。MALDI-MS特點對于一些分子量較大(1000000Da)或疏水性強的蛋白質，MALDI比 ESI 更有效。MALDI能有效地分析較復雜的肽混合物或物理化學性質相差較大的蛋白質混合物。只要能與所選擇的底物形成穩(wěn)定的分散體系的樣品都能用 MALDI進行分析。MALDI不受樣品所含的添加物、緩沖液或鹽的影響，且

27、靈敏度也比別的離子化方式高。核磁共振光譜學.具有非零自旋量子數(shù)的原子核具有自旋角動量,因而也就具有磁矩, 例如象 1H, 31P, 13C, 15N 等原子核.磁矩是一矢量. 如果含有此類核的物質置放于磁場中 ,原來無規(guī)則的磁矩矢量會重新排列而平行于外加的磁場 .與外磁場同向和反向的磁矢量符合 Boltzmann分布.在數(shù)量上同向與反向的差別很小,但正是這一微小的差別造就了核磁共振光譜學.x-射線衍射技術和 NMR技術在研究蛋白質空間結構中的優(yōu)缺點? x-射線衍射技術固體狀態(tài)，可以測定中-大蛋白質結構，技術更成熟；需結晶，經(jīng)常存在相位問題。NMR技術溶液狀態(tài)，接近生理狀態(tài)，不需結晶，可研究蛋白

28、質動力學過程，可以較方便地研究蛋白質-配體相互作用；只能測定小-中蛋白質結構，技術還在發(fā)展。蛋白質類藥物分析來源：天然來源(提取)；化學合成或者半合成；現(xiàn)代生物技術制備。近年來 SFDA批準的生物技術藥物：干擾素（1b，2b，2a，）；白細胞介素-11；重組人胰島素、重組甘精胰島素注射液、重組賴脯胰島素注射液；白細胞介素 -2；G-集落刺激因子、GM- 集落刺激因子；腫瘤壞死因子-；紅細胞生成素；鏈激酶、葡激酶；人、牛堿性成纖維細胞生長因子、重組人表皮生長因子。氨基酸重要化學反應：*a. 與茚三酮反應:用于氨基酸定量定性測定.b. 與 2,4一二硝基氟苯(DNFB) 的反應（sanger反應）

29、:用于蛋白質 N-端測定.c. 與苯異硫氰酯（PITC ）的反應（ Edman反應）：用于蛋白 N-端測定，蛋白質順序測定儀設計原理的依據(jù)。蛋白質的理化性質：兩性解離性質及等電點： 蛋白質膠體性質； 蛋白質的沉淀；蛋白質的變性與復性；蛋白質的紫外吸收特性； 蛋白質呈色反應。氨基酸組成分析的步驟：水解，衍生（柱前衍生化和柱后衍生化），色譜流程：樣品陽離子交換柱衍生化（茚三酮）檢測柱后衍生化：將水解后的氨基酸樣品經(jīng)過離子交換柱分離。原理：1.氨基酸具有不同的酸堿性，極性，可用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行吸附，用不同PH 和離子強度的緩沖液依次將它們洗脫；2.酸性氨基酸對陽離子交換樹脂的親和力最弱，

30、先洗脫下來； 3. 中性氨基酸對陽離子交換樹脂的親 和力次弱，跟著洗脫下來；4. 堿性氨基酸對陽離子交換樹脂的親和力最強，最后被洗脫下來；5.洗脫后用茚三酮顯色， 進行定量測定。蛋白質常用的水解方法：酸性水解（鹽酸水解和磺酸水解）；堿性水解；酶水解；微波輻射能水解；膜上蛋白質印跡樣品的水解（原位分析）。鹽酸水解得到除色氨酸和胱氨酸外的氨基酸；堿性水解得穩(wěn)定色氨酸。幾種常見的氨基酸分析方法： 1、茚三酮反應2、熒光胺法3、鄰苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl ）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法蛋白質的 N-末端的測定1、二硝基氟苯法（D

31、NFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl 法）3、異硫氰酸苯酯法（PITC 法）4、DABITC法5、氨肽酶法蛋白質的 C 末端的測定1、羧肽酶法2、硼.氫化鋰法（LiBH4 法，還原法）3、肼解法蛋白質二級結構測定:采用 圓二色光譜 測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。蛋白質三級結構測定X 射線衍射法和核磁共振技術 是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。蛋白質純度檢查： 非還原SDS-PAGE電泳法 和 HPLC 法 (分子篩層析、反相 HPLC 、離子交換層析等)蛋白質含量測定Folin酚- 試劑法(Lowry 法)、染色法(Bradford法)、雙縮脲法、紫外吸收法

32、、HPLC法和凱氏定氮 ELISA 法考馬斯量藍 G250BCA 法（4-甲酸喹啉法）等方法。凱氏定氮法原理：當?shù)鞍踪|與濃硫酸共熱時，被氧化為二氧化碳和水，而氮轉化為氨，氨與硫酸結合成硫酸銨，稱 為“消化”。硫酸銅用作催化劑。消化液轉入凱氏定氮儀反應室中，加入過量濃氫氧化鈉，使硫酸銨分解放出氨，將氨驅入過量的標準硼酸溶液中，用標準鹽酸進行滴定。雙縮脲法原理：蛋白質含有兩個以上的肽鍵。在堿性溶液中與Cu2+ 形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比。540nm 比色。福林酚法原理：蛋白質用堿性銅溶液（酚試劑）處理，使其形成銅蛋白質絡合物。該絡合物中的酪氨酸，色氨酸能還原磷鉬酸-磷鎢酸試

33、劑（Folin試劑），產(chǎn)生深藍色。660nm 比色。蛋白質相對分子質量測定 ：還原型 SDS-PAGE 法測定；凝膠過濾(分子篩)法：根據(jù)蛋白分子大小和形狀進行測定，誤差比 SDS-PAGE 大；質譜法；梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳。梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 ：在梯度凝膠電泳中，蛋白質在電場中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸減小的方向遷移，隨著電泳的繼續(xù)進行，蛋白質受到孔徑的阻力越來越大。在梯度凝膠電泳中，蛋白質的最終遷移位置 僅取決于它本身分子的大小，與蛋白質電荷密度無關。蛋白質的相對遷移率與其分子量的對數(shù)在一定范圍內呈線性關 系。肽圖常用的分析方法有：（1）SDS-PAGE 電泳（2）反相

34、 HPLC(RP-HPLC) （3）毛細管電泳（4）液質分析。糖蛋白的糖基化分析 : 糖基化位點,分子量,糖的組成,連接方式,分析方法: 酶解,質譜,LC/MS,GC/MS宿主細胞蛋白含量：雙抗體夾心 ELISA概念：宿主細胞蛋白質一般簡稱宿主蛋白，是指生產(chǎn)過程中來自宿主或培養(yǎng)基的殘留肽等雜質。基因工程藥物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA 法測定。測定方法 包被；加樣；加抗體；檢測。*宿主細胞 DNA 殘留量測定方法概念：供試品中的DNA 經(jīng)變性為單鏈后吸附與固相膜上，在一定溫度下。可與相匹配的單鏈 DNA 復性而重新結合成雙鏈 DNA ，稱為“雜交”。將特異性 DNA 探針標記后，與吸附在

35、固相膜上的供試品單鏈 DNA 雜交，并使用與標記物相應的顯示系統(tǒng)顯示雜交結果，與已知含量的陽性 DNA 對照對比后，可測定供試品中外源性 DNA 的含量。*宿主細胞 DNA殘留量測定方法： 標記 ；雜交；免疫檢測蛋白質最終產(chǎn)品的控制*1物理化學鑒定（1）氨基酸組成（2）氨基酸末端序列 N-端和C-端氨基酸（3）肽譜（4）巰基和二硫鍵巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置（5）碳水化合物結構中性糖、氨基糖、唾液酸（6）分子量應用分子篩層析法、SDS-PAGE（還原和/或非還原條件下）、質譜測定法（7）等電點 通過等電聚焦電泳或其他適當?shù)姆椒y定。（8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）（9）電泳圖型（10）液相層

36、析圖譜 分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù) （11）光譜分析2. 雜質檢查（1）工藝相關雜質（2）產(chǎn)品相關雜質3. 生物學測定（1）鑒別試驗應用免疫印跡法（2）效價測定（3）特異比活性測定（4）熱原質試驗（5）無菌試驗（6）抗原性物質檢查（7）異常毒性試驗氨基酸定量法：茚三酮法，三硝基苯磺酸法，銅復合物紫外吸收法，甲醛滴定法，非水溶液滴定法，雙波長分光光度法，導數(shù)分光光度法，HPLC 。*茚三酮法：茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，還原型茚三酮。還原型茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合

37、生成藍紫色的物質。最大吸收值波長 570nm.*甲醛滴定法：在 PH 中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結合，使平衡向右移動，促使氫離子釋放，使溶液酸度增加。每釋放出一個氫離子，相當有一個氨基酸。(成品測定)非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標準溶液滴定其含量。適合成品測定)，有直接滴定法和回滴法。合成多肽藥物類藥物分析化學合成多肽分類:純天然多肽；經(jīng)結構修飾的天然多肽；人工設計出的多肽。制備方法：液相合成和固相合成液相合成的優(yōu)點:中間產(chǎn)物純化、中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失。缺點：是較為費時、費力等。固相合成優(yōu)點：是簡化了每步反應的后處理操作，避免因

38、手工操作和物料轉移而產(chǎn)生的損失，產(chǎn)率較高且能夠實現(xiàn)自動化等。缺點：是每步中間產(chǎn)物不可以純化，必須采用較大的氨基酸過量投料，粗品純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段進行純化等。液相合成法較適于合成 短肽；固相合成法更適于合成 中、長肽 。多肽藥物不穩(wěn)定的原因:水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、消除、凝聚、沉淀、吸附等。結構確證研究1. 短肽 ：元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質譜等常見方法，氨基酸序列測定。2. 中、長肽 ：氨基酸組成，氨基酸序列分析。（Edman 降解，質譜：分子量及其序列信息，是對 Edman 降解的很好補充。）原料藥的質量研究項目一般包括：外觀

39、性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機溶劑和反應試劑殘留量、生物學安全性檢查、含量和/或活性效價測定等。相關肽檢查（或稱有關物質檢查）：RP-HPLC ，（HPIEC ）、毛細管電泳技術，高效分子排阻色譜（ HPSEC ）、（PAGE ）以及激光散射粒度測定等技術。酶類藥物分析酶的分類：氧化還原酶;轉移酶；水解酶；裂合酶；異構酶；合成酶（或稱連接酶）酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉化 1mol 底物所需要的酶量，稱一個酶的活力單位。酶的比活力每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg 。*酶活性測定影響因素 ：底物；pH ；溫度；酶濃度 ；空白和對照。以 Km 最小

40、者作為此酶的生理底物底物與產(chǎn)物的測定方法 （酶反應的檢測方法）1、化學方法：用化學法測定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。2、分光光度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。3、熒光測定法： 簡單、靈敏、快速。4、電化學分析法（1）離子選擇性電極分析法（2）微電流法5、其他方法：如測定氣體的測壓法，測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法。酶活力測定方法（固定時間法，連續(xù)監(jiān)測法，固定濃度法）1. 固定時間法在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫 一定時間 ，然后測定 產(chǎn)物生成的量或底物消耗的量 ，從而計算出酶的含量（或活力）。2.連續(xù)監(jiān)測法在酶反應過程中，連續(xù)記錄不同時間的底物消耗量或產(chǎn)物生成量。（一）、需 NA

41、D+ 或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：直接測定法 ；偶聯(lián)法 ； 三聯(lián)酶活測定還原型輔酶（NADH和 NADPH）在 340nm 處有紫外吸收，氧化型輔酶（NAD+ 和 NADP+ ）在 340nm 處無紫外吸收.利用 340nm 處每分鐘吸收度升高或降低的速率與酶活性成正比的關系，推算出酶的活力單位。A. 直接測定法大多數(shù)需 NADH （NADPH ）參加的脫氫酶，可利用紫外分光光度法直接測定反應體系在 340nm 處吸收度的變化， 計算酶活力單位。B. 偶聯(lián)法此類酶催化反應不需 NAD+ 或 NADP+ ，但當與需 NAD+ 或 NADP+ 的脫氫酶反應偶聯(lián)以后，能用紫外分光光度法測定.C

42、. 三聯(lián)酶活測定引入一個輔助酶反應，將被測酶反應系統(tǒng)與指示酶反應系統(tǒng)聯(lián)系起來，組成一個“三合一”酶反應系統(tǒng)，使底物轉化率、輔助酶反應和 NADH （NADPH ）氧化速率之間成正比函數(shù)關系，輔助酶和指示酶的活力必須大大超過測定酶活力。（二）、不需 NAD+ 或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身無色，經(jīng) 酶作用后釋放出有色的反應產(chǎn)物 。根據(jù)反應過程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。3.固定濃度法根據(jù)酶催化反應，使 反應產(chǎn)物 達到額定的濃度時其反應時間與酶濃度成反比的原理進行設計的。正交設計多因素選擇正交試驗設計（Orthogonal experimental

43、design）是一種高效的利用正交表來安排多因素多水平設計試驗的方法。通過巧妙的安排和分組，用較少的試驗次數(shù)，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的試驗條件。利用各因素所對應指標的極差 R 及平均極差 D 作出判斷。*酶類藥物的檢測 （底物，原理，靶點）1. 肽鍵水解酶 ：1、胰蛋白酶 2、彈性蛋白酶 3、尿激酶（氣泡上升法）*胰蛋白酶原理胰蛋白酶專一作用于 賴氨酸、精氨酸 等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵>酰胺鍵> 肽鍵。底物：BAEE；BAA苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE ）在胰蛋白酶的作用下， 酯鍵 被水解生成苯甲酰L精氨酸，在 253nm 波長處的吸收

44、度隨酶促反應遞增，因此連續(xù)記錄不同時間的產(chǎn)物生產(chǎn)量，根據(jù)活力單位定義計算酶活力。*胰彈性蛋白酶（肽鍵水解酶） 底物：剛果紅彈性蛋白胰彈性蛋白酶測定原理剛果紅彈性蛋白法：以剛果紅彈性蛋白為底物，由于剛果紅彈性蛋白結合的共價鍵能被彈性酶水解，根據(jù)剛果紅在 495nm 處有最大吸收，由標準曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。單位：20 分鐘水解 1mg 剛果紅彈性蛋白所需的酶量為一個彈性酶活力單位。尿激酶（堿性蛋白水解酶）作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶。效價測定原理(氣泡上升法)尿激酶激活人體內纖維蛋白溶酶原使其轉化成纖維蛋白溶酶；纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉變成纖維蛋白凝

45、塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時間的對數(shù)成直線關系。反應系統(tǒng)應在 3045 秒內凝結，當凝塊內小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時作為反應終點。以尿激酶的濃度為橫坐標，以反應時間的對數(shù)為縱坐標。底物：纖維蛋白溶酶原2. 脂鍵水解酶胰脂肪酶底物: 橄欖油3. 糖苷鍵水解酶 溶菌酶（能分解粘多糖的堿性水解酶）效價測定 比濁法底物: 溶酶小球菌以 溶酶小球菌 為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由 NAG和 NAM重復而成。只能水解 NAM C1和 NAG C4之間的1，4 糖苷鍵。4. 超氧化物歧化酶 SOD測定方法：間接法：使

46、用氧自由基指示清除劑， SOD與指示清除劑競爭 O2- ，從而抑制指示清除劑與 O2- 的結合，根據(jù)指示清除劑與 O2- 反應速度的變化可間接測定 SOD 的活性。間接法包括：黃嘌呤氧化酶細胞色素 C 法和鄰苯三酚法。*黃嘌呤氧化酶細胞色素 C 法原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時產(chǎn)生O2- ，氧化型細胞色素C 被 O2- 還原為還原型細胞色素 C ，后者在 550nm 有最大吸收，因此測定氧化性細胞色素 C 在加入 SOD 前后的光吸收變化可間接計算酶活性。鄰苯三酚法原理：在堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅 棓酚，同時生成 O2- ，當有 SOD存在時由于它能

47、催化O2- 與 H+ 結合生成 O2 和 H2O2 ，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累。定義:在一定條件下， 每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50的酶量 為一個酶活力單位。多糖類藥物分析多糖的理化性質: 旋光性 ; 硫酸蒽酮反應（620nm ）硫酸苯酚反應(490nm) ;氨基己糖乙酰丙酮(525nm) 糖; 醛酸硫酸咔唑(520nm) .多糖的純度測定：超離心法，電泳法，凝膠色譜法，旋光法。多糖的分子量測定1. 凝膠層析法 ：將分子量不同的蛋白質通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。Sephadex G-200，多糖標準品。分部收集，

48、硫酸-苯酚檢測，分別求得洗脫體積 Ve， Ve 與 1gM 之間存在著線性關系， 繪制標準曲線。Ve=-KlogM+C將待測樣品上柱，待測多糖 Ve。通過標準曲線求出待測多糖分子量。2. 粘度法3. 超離心法4. 高效液相色譜（重均分子量）色譜條件： 凝膠柱（分子量大?。?，示差折光檢測器。標準曲線：LogMW = a+b tRMW為重均分子量，tR 為保留時間待測多糖分子量 （重均分子量）Mw= (RIiMi)/RIiMi 為供試品在保留時間 ti時的分子量，RIi在第 i部分中被洗脫物質的量（重量）。多糖的含量測定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物測定法（肝素鈉）生色

49、底物法（低分子量肝素鈉） 1.乙酰丙酮法氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對二甲氨基苯甲醛反應，反應物呈紅色，于 525nm 測定吸收度。2.硫酸咔唑法測糖含量（己糖醛酸測定）在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應生成的反應物呈紅色。520nm 比色3.硫酸苯酚法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強酸性條件下，與苯酚反應生成橙色衍生物。它在 490nm 處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關系。4.蒽酮法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍色化合物，620nm 進行比色測定

50、。*生色底物法原理肝素、低分子肝素當?shù)鞍酌福‵a）從生色底物分裂出 pNA 時，發(fā)色物的產(chǎn)生量 與剩余的酶量成正比，與 肝素效價成反比 。405 nm 測定。（pNA 對硝基苯胺）酰胺分解法當?shù)鞍酌笍纳孜锓至殉?pNA 時，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與 肝素效價 成 反比 。405 nm測定。*生色底物法(抗 Xa 因子活性測定 )以溶液吸收度和濃度的對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中 量反應平行線 測定法計算出供試品的抗 Xa 因子活性. 生色底物：Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；對-硝基苯胺（pNA ）。多糖類藥物的結構分析1. 糖苷鍵連接方式的測定 A.紅外光譜糖苷鍵

51、類型確定吡喃糖糖苷鍵時，用紅外光譜，在 890cm-1 處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵在 840cm-1 處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵。B.核磁共振譜糖苷鍵（型或型）。2. 糖苷鍵連接位置的測定*（一）、高碘酸氧化、Smith 降解原理：選擇性的氧化降解反應，能夠作用于多糖分子中 1，2二羥基和 1，2，3三羥基，生成 過碘酸氧化產(chǎn)物 ； 此產(chǎn)物用 硼氫化鈉 還原后，再用酸水解，生成相應的醛、甲酸。室溫下用 稀無機酸 水解還原產(chǎn)物。A. 1，2 連接的糖苷鍵1，2 連接的糖苷鍵經(jīng) 高碘酸氧化 后的產(chǎn)物用 硼氫化鈉還原 得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用 稀鹽酸 水解，得到甘油及甘油醛。B. 1，3

52、 連接的糖苷鍵1，3 連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應，經(jīng)還原與水解后得到原來的 單糖 。C. 1，4 連接的糖苷鍵1，4 連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。D. 1，6 連接的糖苷鍵1，6 連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。（二）、甲基化反應產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以 氣相色譜 鑒定甲基化水解產(chǎn)物。如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成 二甲基單糖 。（三）、乙酰解后質譜分析原理：多糖經(jīng)過乙?；磻ù佐⒈姿?/p>

53、）生成乙?；瘑翁呛凸烟?。用氯仿抽提，蒸去氯仿，進行質譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結構。抗生素類藥物分析*微生物檢定法定義：是利用微生物發(fā)育時對某些物質的特殊依賴性，按這些物質對微生物生長的影響，對他們作出定量鑒定的方法。*微生物檢定法可分為三類：稀釋法；比濁法 ；瓊脂擴散法（管碟法）。*牛津單位:抑制 50 毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長的青霉素的最低含量為一個牛津單位.一個牛津單位相當于 0.6ug的青霉素鈉鹽所具有的抗生活力，1mg 青霉素G 鈉鹽含有 1667 個牛津單位,(IU)（一）稀釋單位 (u/ml，u/mg)將 1mg 抗生素配成溶液，在

54、一定條件下進行稀釋，對某一細菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為1mg 抗生素中可含有的單位。（二）重量單位 (u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作為抗生素的單位。稱重量單位.1 類似重量單位: 以抗生素鹽類純品的重量為單位。包括無生物活性的酸根和金屬離子。2 重量折算單位：以與原始的生物活性相當?shù)募兛股貙嶋H重量為一個單位，3 特定單位 ：以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個單位，經(jīng)有關國家權威機構認可而定.效價測定的方法：稀釋法；比濁法；瓊脂擴散法。稀釋法原理 ：用液體培養(yǎng)基逐級將抗生素稀釋，在各管中加入等量的試驗菌液，進行培養(yǎng)，觀察抑制細菌生長的最低抗生素濃度，再與同法測定

55、的標準品終點作比較，從而求得被測抗生素的效價。比濁法原理 ：將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養(yǎng)基內，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)（約 3-4h），測量培養(yǎng)基濁度，其濁度與細菌數(shù)、細菌群體質量存在直接關系，在一定的范圍內符合比耳定律。細菌數(shù)、細菌群體質量又直 接受抗生素效價的影響。影響因素：一、影響比濁法的物理因素：1、散射現(xiàn)象 2、菌液濃度 3、細菌體大小的變化二、培養(yǎng)基：在沒有外加抑制劑的情況下，菌體的生長受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng)溫度、通氣等條件影響。三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時間 3 小時，可縮短為 2 小時。*管碟法原理: 抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內擴散，形成一定濃度抗生素

56、的 球型區(qū) ，抑制試驗菌生長，通過透明培養(yǎng)基觀察抑菌圈， 抗生素劑量的對數(shù)與抑菌圈面積或直徑成正比 。在同樣條件下將已知效價的標準品溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反應(抑菌圈)進行比較；當標準品和供試品是屬于同一性質的抗生素時 ，標準品溶液和供試品溶液對一定試驗菌所得的劑量反應曲線，在一定劑量范圍內應互相平行。根據(jù)以上原理，可設計為一劑量法、 二劑量法 及三劑量法。從而可以較為準確地測定供試品的效價。log M(1 /9 .21 DT )r 2log C4 DTH)T = 擴散時間M = 抗生素在管中的量L = 管的高度H = 培養(yǎng)基的厚度D = 擴散系數(shù)r = 抑菌圈半徑c = 最低抑菌濃度影響抑菌圈半徑的因素： D 的影響因素 ：抗生素本身結構、分子量等，結構簡單者容易擴散，分子量大的擴散就慢，雜質 ：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質，雜質本身也有擴散系統(tǒng)，看干擾抗生素的擴散，影響抑菌圈的大小和清晰度。瓊脂含量