第4講 細胞核移植

1、6.4細胞核移植細胞核移植（一）定義（一）定義細胞核移植（Cell nuclear transfer）是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細胞內(nèi)的技術(shù)。細胞核移植動物培育是用特定發(fā)育階段的核供體及相應(yīng)的核受體（去核的卵子）體外構(gòu)建重組胚，通過胚胎移植達到擴繁種群的目的。細胞核移植所得到的動物為核質(zhì)雜種。克隆動物克隆動物生物的主要遺傳物質(zhì)存在于細胞核中，因此克隆動物可以通過細胞核移植實現(xiàn)。與其他克隆的區(qū)別與其他克隆的區(qū)別克隆 (Clone)本意是指遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一生物個體的無性繁殖群體。廣義上的克隆包含有基因水平、細胞水平、胚胎水平、個體水平

2、上的復(fù)制。細胞工程的克隆克隆是指通過無性繁殖手段獲得遺傳背景相同的細胞群或個體的技術(shù)。通過植物組織培養(yǎng)再生植物屬于植物個體的克隆?？寺游镆话阒覆捎煤艘浦?、胚胎移植技術(shù)得到的動物。核移植主要包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。利用胚胎分割得到的動物屬于廣義上的克隆動物。（三）克隆動物的發(fā)展歷史（三）克隆動物的發(fā)展歷史1早在1892年，Driesch和Wilson就分別對海膽和文昌魚分離卵裂球的進行了動物克隆的嘗試。21938年，德國胚胎學(xué)家斯佩爾曼（Spemann）經(jīng)提出“分化細胞的核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育”這樣的設(shè)想，并在兩棲類脊椎動物進行了克隆動物實驗，由于當(dāng)時技術(shù)等方面的原因使他沒能找

3、到將細胞核導(dǎo)入卵細胞的方法。31952年Briggs和King成功地在豹蛙上獲得了胚胎細胞核移植后代。41980年中國將鯽魚胚胎細胞移入鯉魚去核的未受精卵中實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。5-1984年，丹麥科學(xué)家斯丁維拉德森成功利用胚胎細胞克隆出一只綿羊，這是首次證實的通過核移植技術(shù)克隆哺乳動物。證明胚胎細胞具有全能性。里程碑式的突破里程碑式的突破61997年，英格蘭愛丁堡羅斯林研究所和PPL制藥公司利用高度分化的綿羊乳腺上皮細胞，通過核移植克隆了一只雌性小綿羊多莉。這是第一個體細胞克隆動物。 證明：成熟的體細胞也具有全能性。 （二）技術(shù)流程（二）技術(shù)流程細胞核

4、移植克隆動物技術(shù)環(huán)節(jié)主要包括：核供體細胞的準(zhǔn)備受體細胞的去核細胞核移植、激活重組胚的培養(yǎng)與移植核移植后代的鑒定。1核供體細胞獲得與取核供核細胞可以是動物原代細胞或傳代細胞。分離制備單個動物細胞，體外培養(yǎng)得到正常二倍體體細胞系，然后進行15 天的缺血饑餓培養(yǎng)，誘使細胞處于“靜止”狀態(tài)（一般進入G0 期）。采用細胞松弛素B（Cytochalasin B）誘發(fā)細胞排核或者顯微操作取核等方法得到細胞核。2受體細胞去核可以用微細玻璃管吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細胞質(zhì)。也用熒光染料Hoechst33342對卵細胞DNA進行染色，在紫外觀察下去核可提高去核成功率。也可以使用Hoechst

5、33342與卵細胞DNA結(jié)合后，用紫外線定點照射使核功能喪失。3 細胞核移植細胞核移植可以采用胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射方法。前者是用微吸管吸取供體核后，直接注射進卵子細胞質(zhì)；后者是把細胞核注射進透明帶和卵細胞間的卵周隙中。在細胞核移植時，供體和受體細胞周期的影響非常重要。處于G0/G1 的細胞為二倍體，會凝集成單個染色單體，處于G2 期的4倍體核會凝集成雙倍染色單體。處于活躍復(fù)制的核（S期）會形成典型的“粉末狀”形態(tài)，會引起DNA損傷。研究發(fā)現(xiàn)將G1期雙倍體核移入激活的MII期卵中獲得了較高的重構(gòu)胚發(fā)育幾率。4激活正常受精卵的發(fā)育啟動和早期卵裂主要由卵母細胞胞質(zhì)中母源信息所控制，成熟的卵母細胞

6、質(zhì)能使移入的細胞核在形態(tài)上和功能上發(fā)生變化，從而導(dǎo)致供核回復(fù)到初始狀態(tài)，基因從頭開始順序表達。重組胚的發(fā)育需要進一步激活，可以采用電激活和化學(xué)激活方法。電激活是可把重組胚放在電融合槽兩極之間，用幾次瞬時直流脈沖刺激使其激活?；瘜W(xué)激活常用的激活劑包括乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素等。5重組胚培養(yǎng)和移植激活后的重組胚可以采用體內(nèi)和體外兩種培養(yǎng)方式。體內(nèi)培養(yǎng)是將重組胚植入同種或異種動物的輸卵管中發(fā)育至囊胚或桑葚胚，然后進行胚胎移植。體外培養(yǎng)是將重組胚在特定培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移入同種的同期發(fā)情的受體中繼續(xù)發(fā)育。6體細胞核移植后代的鑒定對于體細胞核移植培育的動物，可以從形態(tài)性別上鑒定

7、，還可以采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定。（三）胚胎細胞克隆動物（三）胚胎細胞克隆動物（四）（四）體細胞克隆動物體細胞克隆動物（1）定義）定義體細胞克隆體細胞克隆技術(shù)是將動物體細胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)使其處于休眠狀態(tài)，利用細胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細胞，培育成早期胚胎，將胚胎移植至受體，妊娠產(chǎn)仔培育出與核供體一樣的成體動物的一種細胞工程技術(shù)。 （2）意義問題思考：問題思考：A-理論價值理論價值：高度分化的高度分化的體細胞具有全能性B-實踐意義實踐意義：由于體細胞數(shù)量豐富并且易于獲得，因此體細胞克隆動物技術(shù)在加快珍稀動物繁殖，搶救瀕危動物（如大熊貓）方面意義重大?？梢杂没颊弑救思毎嘤鲂陆M織。（3）基本過程

8、）基本過程核供體動物的選擇與細胞核的獲得。核受體動物的選擇與細胞核的移出。供體核的移入及原核的取出。胚泡的體外試管培養(yǎng)。代母的選擇與胚泡移入子宮。克隆動物的體內(nèi)發(fā)育與出生。應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例多莉羊多莉羊技術(shù)路線：技術(shù)路線：具體步驟具體步驟1-供核細胞獲得與取核供核細胞獲得與取核取一只6歲已妊娠到后期的白色的芬蘭多特西母羊的乳腺組織，酶消化分解成單個細胞，將這些細胞平鋪在新鮮的細胞營養(yǎng)層（滋養(yǎng)層）上培養(yǎng)7天，將這些細胞轉(zhuǎn)移到卻乏營養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代，其培養(yǎng)基的胎牛血清濃度從10%下降至0.5%，這樣使細胞停在休止期（G0） 。（傳到7-9代時，供體細胞可停在休止期，此時細胞染色體為54個，是二倍

9、體）。在倒置顯微鏡下，用顯微吸管將核吸出。2-卵母細胞收集與去核卵母細胞收集與去核受體卵細胞來自于蘇格蘭黑綿養(yǎng)，在注射促性腺釋放素(GnRH)28-33h時，收集卵細胞。在倒置顯微鏡的視野下用顯微吸管刺入，吸取中期染色體和少量細胞質(zhì)。去核后卵細胞放在無鈣鎂，但含有1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中復(fù)原，然后轉(zhuǎn)移到37度無鈣、但含有10%的胎牛血清的M2培養(yǎng)液中保存?zhèn)溆谩?-3-細胞核融入卵細胞細胞核融入卵細胞將核和已去核卵細胞放入同一培養(yǎng)皿中，在交變脈沖電壓為3伏的電場中融合5分鐘，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流電脈沖3次，將乳腺細胞核融入卵中形成一個含有新遺傳物質(zhì)的卵細胞，稱之為重構(gòu)胚。4

10、-重構(gòu)胚的培養(yǎng)將重構(gòu)胚種植在綿羊結(jié)扎的輸卵管中培養(yǎng)，大約培養(yǎng)6天后，大多數(shù)胚胎發(fā)育到桑椹期或囊胚期（816個細胞）。再選擇發(fā)育優(yōu)良的重構(gòu)胚移植到蘇格蘭黑綿羊的子宮中，每只受體母羊移植1-3個重構(gòu)胚。5-妊娠監(jiān)護妊娠60天時用超聲波診斷妊娠。每兩周進行一次全方位監(jiān)護胎兒發(fā)育。分娩時由獸醫(yī)外科醫(yī)生助產(chǎn)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。人類胚胎克隆與克隆人人類胚胎克隆與克隆人2001年研究人員將一枚卵細胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮膚細胞中的細胞核替代上述DNA，得到3個早期胚胎，其中兩個發(fā)育到4細胞階段，另一個至少發(fā)育到6細胞階段。證明人體單個細胞的遺傳物質(zhì)能被誘導(dǎo)發(fā)育成為幼胚胎

11、，因此這項研究被認為是向著克隆人的方向邁出了關(guān)鍵一步。克隆人？克隆人？布瓦瑟利耶安蒂諾里克隆引起的倫理學(xué)問題討論討論題：討論題：1-動物可以無休止地被克隆嗎？動物可以無休止地被克隆嗎？2-你是否同意生殖性克?。繜o性生殖是否是你是否同意生殖性克?。繜o性生殖是否是人類的倒退？人類的倒退？3-英雄、偉人可以通過克隆再生嗎？英雄、偉人可以通過克隆再生嗎？問題1：克隆羊多莉剛出生時，它的染色體顯示已經(jīng)有好幾歲了。2003年它已經(jīng)永遠離開了我們。6歲。供體6歲。蘇格蘭羅斯林研究院的科學(xué)家們對多莉的染色體做了仔細的研究，發(fā)現(xiàn)其染色體末端端粒比同齡的普通綿羊短。端粒是決定細胞老化的主要因素，端粒越短的細胞越接

12、近死亡。變短的端?；蛟S表明遺傳的藍本會隨著時間流逝而老化，無休止地克隆一個動物是不可能的。關(guān)于端粒關(guān)于端粒每一條染色體的末端都有特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒(telomere)。每一個端粒都含有一系列的短的正向重復(fù)順序。在細胞中，端粒總是和一些非組蛋白相結(jié)合，形成復(fù)合體。它可以保持染色體的穩(wěn)定性，丟失了端粒的染色體很容易和別的染色體相接形成雙著絲粒染色體或自身首尾相聯(lián)形成環(huán)狀染色體，前者在減數(shù)分裂后期會產(chǎn)生染色體橋(chromosome bridge)，最終引起染色體的重復(fù)與缺失。生殖細胞可以重建與延長端粒的DNA；而體細胞則隨著復(fù)制次數(shù)的增加端粒DNA會逐漸縮短。Harley等（1989年）用人的端粒重

13、復(fù)片段為探針對胎兒、新生兒、青年和老年人的細胞株的端粒長度進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，人成纖維細胞端粒的長度不斷下降。因此端粒DNA可能決定了細胞的壽命，并與細胞的自然凋亡與癌變密切相關(guān)。1990年Harely等則認為端粒的長度可反映細胞有絲分裂的次數(shù)。端粒象是細胞分裂的“計數(shù)器”。問題2：許多國家出臺法律禁止生殖性克隆。有性生殖是歷史進化的結(jié)果，利于種族繁衍和生存，以及優(yōu)良性狀的形成。選擇無性生殖克隆的方式不利于遺傳多樣性的保護。從有性繁殖到無性繁殖，就進化而言是一種退化?？寺游锎嬖诘膯栴}克隆動物存在的問題1） 技術(shù)尚不成熟技術(shù)尚不成熟得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，

14、克隆試驗的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過程中，科學(xué)家共克隆出個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個。目前，多莉羊的制備還不能重復(fù)，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動物或其它不同組織器官的細胞。2） 遺傳、疾病問題 克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng) 缺陷和心肺功能不健全的問題?？寺游餂]有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。 3） 克隆人帶來的社會、倫理學(xué)問題父子？兄弟？母親？歸屬感？人的唯一性問題。犯罪問題我是誰？“多利羊”制造者反對克隆人伊斯維姆伊斯維姆.穆特穆特“我認為，已經(jīng)有足夠的證據(jù)表明，克隆人的行動是完全不負責(zé)