實(shí)驗(yàn)親和層析純化IgG

1、上次實(shí)驗(yàn)總結(jié)上次實(shí)驗(yàn)總結(jié)配基 特異性Protein A許多IgGs 的Fc 片斷Protein G許多IgGs 的Fc 片斷Antigen特異的抗體Anti-IgG特異免疫球蛋白抗體純化配基類(lèi)型 族特異性族特異性專(zhuān)一特異性二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理用用 rProtein A Sepharose 分離分離IgGColumn: HiTrap Protein A FF結(jié)合緩沖液: 20 mM 磷酸鈉, pH 7.0洗脫緩沖液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3注意: 為了保護(hù)抗體的活性，將洗脫組分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理種屬種屬蛋白蛋白 A 蛋

2、白蛋白 G結(jié)合結(jié)合結(jié)合結(jié)合人人IgA可變的可變的-IgD - -IgEIgG1 + +IgG2 + +IgG3 -+IgG4+ +IgM* 可變的可變的-鳥(niǎo)類(lèi)蛋黃鳥(niǎo)類(lèi)蛋黃IgY- -牛牛 + +狗狗 + +山羊山羊 - +豚鼠豚鼠IgG1 + +IgG2 + +倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠 + +馬馬 + +考拉考拉 - +駱駝駱駝 - +種屬種屬蛋白蛋白 A 蛋白蛋白 G結(jié)合結(jié)合結(jié)合結(jié)合恒河猴恒河猴 + +大鼠大鼠IgG1 + +IgG2a + +IgG2b + +IgG3 + +IgM* 可變的可變的 -豬豬 + +兔兔 + +小鼠小鼠IgG1 - +IgG2a - +IgG2b - +IgG3 + +綿羊綿

3、羊 +/- + 相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度 弱或不結(jié)合弱或不結(jié)合緩沖液： 平衡液：20mM磷酸二氫鈉，150mM氯化鈉，pH7.2；(1L) 沖洗液：20mM磷酸二氫鈉，0.5M氯化鈉，10mM EDTA二鈉，pH7.2；(1L) 洗脫液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氫氧化鈉。(1L)稀釋血清： 取2ml血清，用平衡緩沖液稀釋5倍，0.45um針頭濾器過(guò)濾。標(biāo)記為S.濃縮膠濃縮膠（5 ml）雙蒸水雙蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%膠膠貯液貯液10% SDSTEMED 10% AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5

4、 l50 l分離膠分離膠（10 ml）雙蒸水雙蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl膠貯液膠貯液10% SDSTEMED10% AP7.5%12%10%4.8ml3.3ml4.0ml2.5ml2.5 ml2.5ml2.5ml4 ml3.3 ml100 l100 l100 l10 l10 l10 l100 l100 l100 l01234567100ug/ml牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(ml) 0.20.40.60.81.0 樣品待測(cè)液(ml) 0.50.5蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.2 0.50.5考馬斯亮藍(lán)G-2505.05.05.05.05.05.05.05.0各管均勻，室溫下放置5分鐘，在=595n處比色吸光度（OD595） 蛋白質(zhì)含量（ug）020406080100 A595 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品的測(cè)定將凝膠至于薄板上（水潤(rùn)避免破損），并至于白色背