低氧預(yù)適應(yīng)對移植肝內(nèi)膽管的顯微及超微結(jié)構(gòu)的影響.

1、低氧預(yù)適應(yīng)對移植肝內(nèi)膽管的顯微及超微結(jié)構(gòu)的影響作者：張培建 周斌 金成 李勇 田田 馮敏 劉新顏 卜 平 作者單位：揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科教研室【摘要】 目的：探討移植肝內(nèi)膽管的顯微和超微結(jié)構(gòu)的變化以及低 氧預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用。方法：建立大鼠自體原位肝移植模型，30 只 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組， A 組：自體原位肝移植組； B 組：低氧預(yù)適應(yīng)后行自體原位肝移 植組；C 組：假手術(shù)組。術(shù)后 48 h 取材，檢測各組血清膽紅素水平，光學(xué)顯 微鏡下觀察各組膽管上皮細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)，透射電子顯微鏡下觀察肝內(nèi)毛細(xì)膽 管的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：A 組血清膽紅素水平比 B 組升高更明顯（PvO.01）;光 學(xué)顯微鏡

2、下，A 組與 B 組相比，膽管上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞排列缺失明顯， 炎性細(xì)胞浸潤增加；電子顯微鏡下， A組與 B 組相比，肝內(nèi)毛細(xì)膽管管腔擴(kuò)張 明顯，微絨毛腫脹、數(shù)量減少或消失的情況嚴(yán)重，膽汁淤積程度明顯。結(jié)論： 低氧預(yù)適應(yīng)對移植肝內(nèi)膽管具有顯著的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞低氧移植物膽管，肝內(nèi)顯微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)Effect on the micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile ductmediated by hypoxic preconditioning after liver graftZHANG Pei-jian, ZHOU B

3、in, JIN Cheng, LI Yong, TIAN Tian, FENG Min, LIUXin-yan, BO PingInstitute of General Surgical Research, Medical College of YangzhouUniversity ( Yangzhou 225001, China )【ABSTRAC】T Objective: To investigate the change of the micro- andultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft an

4、d the protection ofhypoxic preconditioning. Methods: The model of orthotopic autologous livertransplantation was used, thirty SD rats were randomly divided into three groups. A:orthotopic autologous liver transplantation group; B: hypoxic preconditioning beforeoperation group; C: sham operation grou

5、p. The serum bilirubin ,the micro-structure ofbiliary epithelial cell and the ultramicro-structure of cholangiole were determined inthree groups after 48hours after operation. Results: As compared with B group: the serum bilirubinincreased (P0.05) ; the biliary epithelial cell was damaged and inflam

6、matory cellinfiltrated; the cholangiole was distended, microvilli were swelled the degree ofcholestasis were more obviously in group A. Conclusion: The micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft were protected by hy肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)生率高達(dá) 5.8 35，是肝移植后居第 2 位的主要并發(fā)癥 1，嚴(yán)重影響肝移植受者

7、術(shù)后生活質(zhì)量、導(dǎo)致移植物喪失甚 至患者死亡2。非致死性低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning, HP 的大鼠腦組織損傷明顯減輕，這種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象也存在于肝、腎等多種組織器 官3-4 。本研究通過觀察 HP 對移植肝內(nèi)膽管顯微及超微結(jié)構(gòu)的影響，來探 討 HP 對其的保護(hù)作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組SD 大鼠 30 只(揚(yáng)州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，1012 周齡，體質(zhì)量 200250 g。隨機(jī)分為 3 組，每小組 10 只。A 組：自體原位肝移植組；B 組：術(shù)前行 8%J 氧混合氣體的低氧預(yù)處理 90 min5,然后行自體原位肝移植；C 組：假手術(shù)組，僅行開腹，分離

8、肝門部即關(guān) 腹。各組于術(shù)后 48 h 迅速取材。1.2動物模型的制備 大鼠自體原位肝移植參照趙宏峰等 6的模型并進(jìn)行改進(jìn)，具體步驟如下。 1)乙醚半開放式面罩吸入麻醉，術(shù)前 10 min 肌 肉注射阿托品 0.03 mg，仰臥位固定。2)取正中切口進(jìn)腹，進(jìn)腹后逆時(shí)針游離 肝周韌帶。然后游離肝上腔靜脈( suprahepatic vena cava, SVC )、肝下腔靜 脈( inferior vena cava,IVC )。 解剖第一肝門， 游離肝動脈， 從腸系膜下靜 脈和脾靜脈匯合處游離門靜脈(portalvein, PV)至肝門部，并將 PV 壁鞘膜分離干凈。 3)在腸系膜上靜脈及脾靜脈

9、匯合處上無損傷血管夾，輕輕向上向后 提起血管夾，用 4 號針頭刺入 PV,并用無損傷血管夾固定穿刺針，推入肝素鹽 水約 3 mL，使肝臟內(nèi)的血液進(jìn)入體循環(huán)，準(zhǔn)備進(jìn)行冷灌注。4)冷灌注前分別在肝動脈、SVC IVC 上無損傷血管夾，并在 IVC 血管夾稍上方靜脈壁剪開約 1 mn 缺口作流出道。然后經(jīng) PV 穿刺處灌注 4 C 含肝素的乳酸林格液，在灌注的 同時(shí)不斷用4C乳酸林格液澆注肝臟表面降溫。直至肝臟逐漸變成土黃色時(shí)停止灌注。5)灌注完成后拔出穿刺針，用 prolene 縫線修補(bǔ) PV 穿刺點(diǎn)和 IVC 流 出道，并預(yù)松血管夾查看修補(bǔ)是否成功，成功后分別松開PV SVC IVC 及肝動脈的

10、無損傷血管夾，使肝臟復(fù)流，結(jié)束無肝期。同時(shí)用38C生理鹽水 20 mL澆注肝臟表面以快速復(fù)溫。6)關(guān)腹，38C恒溫箱清潔飼養(yǎng)。1.3觀測指標(biāo)及方法 1)心臟取血以全自動生化分析儀測定血清總膽紅素( total bilirubin ， TBIL )、直接膽紅素( direct bilirubin ， DBIL) 和間接膽紅素( indirect bilirubin, IBIL)。 2)肝內(nèi)膽管的顯微結(jié)構(gòu)：動物取血后立即處死，迅速切取肝左葉，取5 mm 10 mm 大小置于 10%勺中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。3)肝內(nèi)毛 細(xì)膽管的超微結(jié)構(gòu)：動物取血后立即處

11、死，迅速切取肝左葉，取1 mmx 1 mm 大小， 2%戊二醛、 1%鋨酸固定后，逐級乙醇脫水、環(huán)氧乙酸置換、浸透、包埋， 超薄切片、鈾酸染色，透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 xs表示，獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)比較兩組間均數(shù)的差異，單因素方差分析比較多組 間均數(shù)的差異。pw0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1膽紅素水平 與 C 組相比較，A 組與 B 組都有不同程度的升高，A組比 B 組升高更明顯（P0.01）;其中以 A 組 DBIL 升高較其他兩組明顯（P 0.05，表 1）。2.2肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化C 組肝

12、內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下呈柱狀，排列整齊;細(xì)胞核位于基底部，無炎癥細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)無 或少有脫落壞死的上皮細(xì)胞。A 組可見膽管上皮細(xì)胞排列紊亂、有缺失；細(xì)胞 腫脹明顯，形態(tài)多樣，部分呈立方狀或柱狀;細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，部分細(xì)胞 出現(xiàn)核分裂；膽管上皮細(xì)胞周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯，管腔內(nèi)可見壞死脫落的細(xì) 胞碎片。B 組肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞損傷程度較 A 組明顯減輕（圖 1）。2.3肝內(nèi)毛細(xì)膽管超微結(jié)構(gòu)變化C 組肝內(nèi)毛細(xì)膽管壁實(shí)際由肝細(xì)胞的界膜作局灶性分隔而形成，管腔直徑約 1 卩 m 其間無細(xì)胞器，腔內(nèi)見散在 分布微絲結(jié)構(gòu)和豐富的微絨毛突起，部分微絲可延伸至膽管微絨毛中。A組毛細(xì)膽管腔明顯擴(kuò)大，其中的

13、微絨毛腫脹、減少或缺失；毛細(xì)膽管腔內(nèi)膽汁淤積 明顯，顆粒成份增加。B 組毛細(xì)膽管腔未見擴(kuò)大，微絨毛豐富，腫脹不明顯； 管腔內(nèi)無明顯膽汁淤積的表現(xiàn)，顆粒成份較少（圖 2）。3討論本研究采用自體原位肝移植模型，很好的模擬了原位肝移植過程中 膽管經(jīng)歷的缺血再灌注損傷（ ischemia and reperfusion injury, IRI）。另外本模型與大鼠異體原位肝移植相比不切斷出入肝的血管，避免了血管吻合， 降低了手術(shù)難度，并且自體移植完全排除了免疫排斥方面的影響，能夠更直 接、更客觀地反映 IRI 對肝內(nèi)膽管的損傷作用 6。隨著對膽道并發(fā)癥認(rèn)識的 深入和外科吻合技術(shù)的提高，由外科技術(shù)原因造成

14、的膽管吻合口并發(fā)癥及引流 管相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率呈下降的趨勢，而非外科技術(shù)因素所導(dǎo)致的以移植物膽 管樹損害為主要特征的供體膽管并發(fā)癥則成為術(shù)后膽管并發(fā)癥的主要類型。一 般認(rèn)為， IRI 是導(dǎo)致非外科性移植物膽管樹損害最重要的始動因素之一7。有研究表明，HP 可以通過促使線粒體在低氧狀態(tài)下糖酵解供能增加，改善移植 術(shù)后的肝臟微循環(huán)，從而提高肝細(xì)胞對肝移植時(shí)較嚴(yán)重的 IRI 耐受力，提高移 植術(shù)后的存活率 8。毛細(xì)膽管由相鄰肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管面構(gòu)成，是膽汁形成和分泌的主 要場所，由毛細(xì)膽管形成和分泌的膽汁約占每日膽汁形成和分泌總量的75%。已有研究指出，毛細(xì)膽管是肝臟中最容易遭受 IRI 的結(jié)構(gòu)之一

15、9，再灌注后 肝細(xì)胞毛細(xì)膽管面可發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變。陳耿等 7在移植肝門靜脈血流 恢復(fù)后 6090 min 取得的標(biāo)本中，見毛細(xì)膽管明顯擴(kuò)張，呈靜脈曲張樣改變，微絨毛消失，同時(shí)伴隨周圍微絲結(jié)構(gòu)的改變和膽汁分泌的減少。本研究同樣顯 示，肝內(nèi)毛細(xì)膽管經(jīng)歷了自體原位肝移植 IRI 后，通過透射電子顯微鏡觀察可 見毛細(xì)膽管腔擴(kuò)張明顯，微絨毛腫脹、減少或缺失；毛細(xì)膽管腔內(nèi)膽汁淤積明 顯，顆粒成份增加。而經(jīng)過低氧預(yù)處理后行自體原位肝移植組，肝內(nèi)毛細(xì)膽管 腔未見明顯擴(kuò)大，微絨毛豐富，腫脹不明顯；管腔內(nèi)無明顯膽汁淤積，顆粒成 份較少。同時(shí)，術(shù)后的血清膽紅素指標(biāo)顯示，與B 組相比，A 組血清膽紅素水平較 C

16、組升高更明顯，其中以 DBIL 升高為主（PvO.01）。兩者結(jié)合均提示經(jīng)過 低氧預(yù)處理后，肝內(nèi)毛細(xì)膽管的功能得到了很好的保護(hù)，術(shù)后膽汁淤積程度明 顯減輕。繼而減輕了肝內(nèi)膽管在肝移植過程中所經(jīng)歷的 IRI ，減少了非外科技 術(shù)因素所導(dǎo)致的膽管并發(fā)癥。由于肝內(nèi)膽管僅由肝動脈供血，故膽管上皮細(xì)胞應(yīng)該是一類高氧 耗、高代謝、低缺氧耐受、易受損的細(xì)胞群體。膽管上皮細(xì)胞內(nèi)缺乏過氧化氫 酶、過氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽等抗氧化的酶系，因而較肝細(xì)胞更易受 到 IRI 時(shí)氧自由基的損傷 10。 Elimadi 等11的研究提示，再灌注后小 葉間膽管上皮細(xì)胞損傷明顯，包括膽管直徑變小、上皮平均面積及微絨毛數(shù)量

17、 減少，甚至引起膽管上皮細(xì)胞干裂、脫落，出現(xiàn)黏膜全層壞死或穿孔，壞死后 纖維組織增生而致狹窄，這是肝移植術(shù)后非吻合性膽管狹窄的重要原因。本研 究顯示，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞經(jīng) IRI 光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞排列紊亂，有缺失； 細(xì)胞腫脹明顯，形態(tài)多樣，部分呈立方狀或柱狀；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，部分 細(xì)胞出現(xiàn)核分裂；細(xì)胞周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯，管腔內(nèi)可見壞死脫落的細(xì)胞碎 片。而經(jīng)過 HP 后行自體原位肝移植組，膽管上皮細(xì)胞損傷程度明顯減輕。說明 HP 對移植肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，可以預(yù)防和減輕肝移植術(shù)后 非吻合性膽管狹窄。但 HP 對其保護(hù)作用的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1吳寶國，鄭

18、樹國，董家鴻，等 .供肝兩種再灌注方式對肝移植術(shù)后早期肝功 能影響的對比研究 J. 消化外科， 2006， 5（3）：175-178.2 Ben-Ari Z, Pappo O, Mor E Intrahepatie cholestasis after livetransplantationJ Liver Transpl ， 2003， 9（10）：1005-10183 Cai Z, Manalo DJ, Wei G, et al. Hearts from rodents exposed to intermittenthypoxia or erythropoietin are protected

19、 against ischemia-reperfusion injuryJ.Circulation， 2003,108 （ 1 ） :79-85.4 Dong JW, Zhu HF, Zhu WZ, et al. Intermittent hypoxia attenuatesischemia/reperfusion induced apoptosis in cardiac myocytes viaregulating Bcl-2/Bax expressionJ. Cell Res, 2003,13（5） ：385-391.5 Stroka DM, Burkhardt T, Desbaillets I, et al. HIF-1 is expressed in normoxic tissueand displays an organ specific regulation under systemic