動(dòng)物細(xì)胞融合

1、關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞融合現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共28頁動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng) 受精作用受精作用兩個(gè)細(xì)胞正在融合兩個(gè)細(xì)胞正在融合現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共28頁動(dòng)物細(xì)胞融合基本過程：動(dòng)物細(xì)胞融合基本過程：現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共28頁誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)方式物理法：物理法：化學(xué)法：化學(xué)法：生物法：生物法：滅活的病毒滅活的病毒電刺激電刺激聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共28頁 聚乙二醇聚乙二醇PEG具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原生質(zhì)體和動(dòng)

2、物細(xì)胞的融合。在不同種類的動(dòng)物生質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞的融合。在不同種類的動(dòng)物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凝集凝集作用作用；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會(huì)發(fā)；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞融合。聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目生細(xì)胞融合。聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有有一定毒性一定毒性，對有些細(xì)胞，對有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞如卵細(xì)胞)不適用。不適用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG誘導(dǎo)融

3、合誘導(dǎo)融合現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共28頁實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 利用利用PEG介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合，其實(shí)驗(yàn)原理到目介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合，其實(shí)驗(yàn)原理到目前為止還沒有完全定論。學(xué)者們一般認(rèn)為，前為止還沒有完全定論。學(xué)者們一般認(rèn)為，PEG改改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜，在修復(fù)時(shí)相互合力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜，在修復(fù)時(shí)相互合并在一起并在一起,

4、使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通, 從而造成相互接觸從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。的細(xì)胞之間發(fā)生融合?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共28頁 利用利用PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合介導(dǎo)細(xì)胞融合, 其融合效果受以其融合效果受以下幾種因素的影響：下幾種因素的影響： PEG的分子量與濃度的分子量與濃度: 細(xì)胞融合效果與細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；的分子量及其濃度成正比；但但PEG的分子量越大、濃度越高的分子量越大、濃度越高, 對細(xì)胞的毒性也對細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為分子量一般為10004000，濃度一般為，濃度

5、一般為4060%。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共28頁2. PEG的的pH值值: 經(jīng)驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證，PEG的的pH值在值在8.08.2之間融合效果之間融合效果最好。最好。3. PEG的處理時(shí)間的處理時(shí)間: 處理時(shí)間越長，融合效果越好處理時(shí)間越長，融合效果越好, 但對細(xì)胞的毒害但對細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng), 故處理時(shí)間可故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共28頁4. 融合時(shí)的溫度融合時(shí)的溫度: 由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融由于

6、生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果果, 在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞度。對于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞, 一般采用的溫度為一般采用的溫度為3840。 而本次試驗(yàn)基本在而本次試驗(yàn)基本在37 的條件下進(jìn)行。的條件下進(jìn)行?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共28頁實(shí)驗(yàn)選材：實(shí)驗(yàn)選材： 本次試驗(yàn)選用本次試驗(yàn)選用雞的外周血雞的外周血做細(xì)胞融合材料做細(xì)胞融合材料, 這是因這是因?yàn)闉? 1. 雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；雞血細(xì)胞具有細(xì)

7、胞核，便于對融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；2. 實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細(xì)胞株做細(xì)實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細(xì)胞株做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)材料所耗的實(shí)驗(yàn)成本和精力；胞融合實(shí)驗(yàn)材料所耗的實(shí)驗(yàn)成本和精力；3.細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行鑒別。若細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核，定為未融合細(xì)胞；有二鑒別。若細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核，定為未融合細(xì)胞；有二至多個(gè)核，定為融合細(xì)胞。至多個(gè)核，定為融合細(xì)胞。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共28頁實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：取新鮮雞血取新鮮雞血, 制成體積分?jǐn)?shù)制成體積分?jǐn)?shù)10%雞紅細(xì)胞懸液。雞紅細(xì)胞懸液。稱稱0. 5gPEG(MW=4000)，熔

8、化。盡快加入，熔化。盡快加入0.5ml預(yù)熱預(yù)熱80的的Hanks 液，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)液，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%PEG，輕輕搖勻，散溫，輕輕搖勻，散溫，置置37恒溫水浴箱中備用恒溫水浴箱中備用（以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶）（以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶）。吸取吸取1 mL 懸液置刻度離心管中懸液置刻度離心管中, 另加另加5 mLHanks 液液,混勻混勻, 離心（離心（1000r/min）5min 。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共28頁吸取吸取0. 5mlPEG加入雞紅細(xì)胞沉淀管內(nèi)，加入雞紅細(xì)胞沉淀管內(nèi)，1min內(nèi)加入離心管中，邊滴邊搖晃內(nèi)加入離心管中，邊滴邊搖晃（此過程必須在（此過程必須在37 水浴箱中進(jìn)行）水浴箱中進(jìn)

9、行）。靜置靜置1min后，加入后，加入9mlHanks液，輕輕液，輕輕吹打混勻，在吹打混勻，在37 水浴箱中放置水浴箱中放置10min。吸棄上清液，使沉淀物松散，置吸棄上清液，使沉淀物松散，置37水浴箱中維持。水浴箱中維持。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共28頁離心（離心（1000r/min）5min,吸棄上清吸棄上清液，加入液，加入1ml不含血清的不含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液，混勻后取混勻后取1滴懸液制成臨時(shí)裝片。滴懸液制成臨時(shí)裝片。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的次甲基藍(lán)染色。鏡檢。的次甲基藍(lán)染色。鏡檢。離心（離心（1000r/min）5min,吸棄上清液，吸棄上清液，加入加入3ml含小牛

10、血清的含小牛血清的1640培養(yǎng)液，輕輕吹培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，置打混勻，置37 水浴箱中溫育水浴箱中溫育30min?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共28頁注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1、注意、注意PEG濃度和作用時(shí)間等，即在制備雞紅細(xì)胞沉淀濃度和作用時(shí)間等，即在制備雞紅細(xì)胞沉淀物時(shí)，一定不要有殘留的液體存在，并且要在物時(shí)，一定不要有殘留的液體存在，并且要在37 水浴水浴鍋中于鍋中于15min內(nèi)全部滴完內(nèi)全部滴完P(guān)EG，這樣融合的效果最好；，這樣融合的效果最好；2、制備、制備50%PEG完后，需置于完后，需置于37 恒溫水浴箱中備用，恒溫水浴箱中備用，以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶；以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶；現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十

11、四頁，共28頁討論：討論： 經(jīng)過小組成員內(nèi)部討論和查閱資料，我們對細(xì)胞融經(jīng)過小組成員內(nèi)部討論和查閱資料，我們對細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的選材有了補(bǔ)充：我們也可以用蟾蜍血紅細(xì)胞進(jìn)合實(shí)驗(yàn)的選材有了補(bǔ)充：我們也可以用蟾蜍血紅細(xì)胞進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并且蟾蜍血紅細(xì)胞也易取得。同時(shí)也可做行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并且蟾蜍血紅細(xì)胞也易取得。同時(shí)也可做蟾蜍血紅細(xì)胞與雞血紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)試劑需蟾蜍血紅細(xì)胞與雞血紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)試劑需要改變：要改變：1、Alsver液：液：葡萄糖葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉，檸檬酸鈉0.8g，氯，氯 化鈉化鈉0.42g，加重蒸水至，加重蒸水至100mL即可。即可。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共28頁4

12、、Ringer溶液：溶液：二氯化鈉二氯化鈉0.25g，氯化鉀，氯化鉀0.42g,氯氯化鈉化鈉6.5g,溶于溶于1000mL重蒸水中。重蒸水中。3、GKN液：液：氯化鈉氯化鈉8g,氯化鉀氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 1.77g,磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉0.69g,葡萄糖葡萄糖2g，酚紅，酚紅0.01g,溶于溶于1000mL重蒸水中。重蒸水中。2、0.85%生理鹽水：生理鹽水：0.85g氯化鈉溶于氯化鈉溶于100mL重蒸水重蒸水中。中。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共28頁5、50%PEG混合液：混合液：稱取少許稱取少許PEG（Mv=4000）放入）放入刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，使其熔化，待冷卻刻

13、度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，使其熔化，待冷卻至至50 時(shí)，放入預(yù)熱至?xí)r，放入預(yù)熱至50 的等體積的的等體積的GKN液，混液，混勻。勻。（注意使用前配置）（注意使用前配置） 但從上述過程看來，實(shí)際配制過程較為繁瑣，因但從上述過程看來，實(shí)際配制過程較為繁瑣，因此，我們還是選擇雞血紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此，我們還是選擇雞血紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共28頁細(xì)胞核的分離和鑒定細(xì)胞核的分離和鑒定實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 一、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核一、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核 . .破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器玻璃勻漿器研缽研缽物理法物理法超聲勻漿器超

14、聲勻漿器凍融法凍融法化學(xué)法化學(xué)法自溶法自溶法酶處理酶處理表面活性劑處理法表面活性劑處理法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共28頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共28頁細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小等都不相同，在同細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小等都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同介質(zhì)和不同轉(zhuǎn)速的離心，將細(xì)胞各種組常用不同介質(zhì)和不同轉(zhuǎn)速的離心，將細(xì)胞各種組分分級(jí)分離出來分分級(jí)分離出來(cell fractionation)。.離心技術(shù)離心技術(shù)組織細(xì)胞勻漿組織細(xì)胞勻漿分級(jí)分離分級(jí)分離分析分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共28頁離離 心心 方方 法法差速沉降

15、離心法差速沉降離心法 速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)密度梯度區(qū)帶離心法帶離心法 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共28頁差速離心法差速離心法differential centrifugation原理：由低速到高速逐漸沉降將不同大小的顆粒分離。原理：由低速到高速逐漸沉降將不同大小的顆粒分離。加速加速 低速低速高速高速 差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為差較大（一般為1010倍）的顆粒。倍）的顆?！，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共28頁二、細(xì)胞核的鑒定二、細(xì)胞核的鑒定 本次試驗(yàn)細(xì)胞選擇的是小白鼠的本次試驗(yàn)細(xì)胞選擇的是小白

16、鼠的肝細(xì)胞肝細(xì)胞，這，這是因?yàn)楦渭?xì)胞分裂旺盛。是因?yàn)楦渭?xì)胞分裂旺盛。鑒定試劑：鑒定試劑：甲苯胺藍(lán)甲苯胺藍(lán)細(xì)胞來源：細(xì)胞來源：現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共28頁 甲苯胺藍(lán)甲苯胺藍(lán)是常用的人工合成染料的一種是常用的人工合成染料的一種,屬于醌亞胺屬于醌亞胺染料類染料類,這類染料一般含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán)這類染料一般含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán),一個(gè)是胺基一個(gè)是胺基,一個(gè)是一個(gè)是醌型苯環(huán)醌型苯環(huán),來構(gòu)成色原顯色。染料除有發(fā)色團(tuán)外來構(gòu)成色原顯色。染料除有發(fā)色團(tuán)外,還要有能還要有能使色原對組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)即助色。使色原對組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)即助色。助色團(tuán)能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類助色團(tuán)能促使染料產(chǎn)生

17、電離成鹽類,幫助發(fā)色團(tuán)對組織產(chǎn)幫助發(fā)色團(tuán)對組織產(chǎn)生染色力生染色力, 使切片上的組織細(xì)胞著色。甲苯胺藍(lán)不僅含有使切片上的組織細(xì)胞著色。甲苯胺藍(lán)不僅含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán)兩個(gè)發(fā)色團(tuán),還含有兩個(gè)助色團(tuán)還含有兩個(gè)助色團(tuán),為堿性染料為堿性染料,因此可以和組因此可以和組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)結(jié)合而使其染色。即可染細(xì)胞核使之呈織細(xì)胞的酸性物質(zhì)結(jié)合而使其染色。即可染細(xì)胞核使之呈藍(lán)色。藍(lán)色。 另外，肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)另外，肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈易染性紫紅色，因此可用于肥大細(xì)胞的檢遇到甲苯胺藍(lán)可呈易染性紫紅色，因此可用于肥大細(xì)胞的檢測，例如色素性蕁麻疹。測，例如色素性

18、蕁麻疹。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共28頁實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1、 頸椎脫臼法頸椎脫臼法處死小白鼠。迅速開腹取肝，在盛有生理處死小白鼠。迅速開腹取肝，在盛有生理鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌。鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌。2、稱取濕重約、稱取濕重約1g的肝組織，量取的肝組織，量取8ml預(yù)冷的勻漿緩沖預(yù)冷的勻漿緩沖液（液（0.25mol/L蔗糖蔗糖-0.003mol/L氯化鈣溶液）并加入氯化鈣溶液）并加入燒杯中，盡量剪碎肝組織。燒杯中，盡量剪碎肝組織。3、將剪碎的肝組織倒入勻漿器勻漿將剪碎的肝組織倒入勻漿器勻漿（勻漿器下段浸（勻漿器下段浸 入入盛有冰塊的小燒杯中保持低溫）盛有冰塊的小燒杯中保持低溫），搗毀組織，直至看不，搗毀組織，直至看不到明顯的組織塊。到明顯的組織塊。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共28頁4、勻漿徹底后，、勻漿徹底后，8層紗布過濾層紗布過濾（先用少量勻漿緩沖液潤濕紗（先用少量勻漿緩沖液潤濕紗布）布），濾液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中。，濾液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中。5、平衡離心管，離心、平衡離心管，離心10min(2500r/min),將上清移入另一玻璃將上清移入另一玻璃離心管中。取上清液制一張涂片離心管中。取上清液制一張涂片,沉淀用殘余液體吹打均沉淀用殘余液體吹打均勻，制另一張涂片勻，制另一張涂片 ，自然干燥。，自然干燥。6、將涂片、將涂片、染色