用于生物質(zhì)酶解過程的纖維素酶研究進展

1、第32卷 增刊1 農(nóng) 業(yè) 工 程 學(xué) 報 Vol.32 Supp.1290 2016年 1月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jan. 2016用于生物質(zhì)酶解過程的纖維素酶研究進展何敏超，許敬亮，陳小燕，孔曉英，袁振宏，張 宇，余 強，劉云云，王 聞（中國科學(xué)院廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源重點實驗室，廣州 510640）摘 要：纖維素酶解效率是木質(zhì)纖維素經(jīng)濟、高效生化轉(zhuǎn)化的限制瓶頸。該文討論了影響纖維素酶酶解經(jīng)濟性與高效性的多個要素，如：高濾紙酶活菌株的選育、發(fā)酵、酶解機理、酶解影響因素及酶

2、解混合體系的優(yōu)化等。該文研究表明，纖維二糖水解酶可能是決定發(fā)酵體系中濾紙酶活高低的關(guān)鍵單酶組分，同時，該酶可能也是預(yù)處理后生物質(zhì)酶解體系中決定濾紙酶活效率的關(guān)鍵單酶組分。酶解過程中關(guān)鍵限速反應(yīng)的認識及關(guān)鍵限制因素形成機制的揭示將成為纖維素酶生化轉(zhuǎn)化研究的重點，這些機理機制的建立可為構(gòu)建高比活力纖維素酶提供理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞：生物質(zhì)；酶；纖維；濾紙酶活；纖維素酶；AA9裂解酶；生化轉(zhuǎn)化 doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 中圖分類號：Q556; Q557 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6819(2016)-Supp.1-0290-07 何敏超

3、，許敬亮，陳小燕，孔曉英，袁振宏，張 宇，余 強，劉云云，王 聞. 用于生物質(zhì)酶解過程的纖維素酶研究進展J. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2016，32(增刊1)：290296. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 He Minchao, Xu Jingliang, Chen Xiaoyan, Kong Xiaoying, Yuan Zhenhong, Zhang Yu, Yu Qiang, Liu Yunyun, Wang Wen. Progress of cellulase that using for biomass

4、 hydrolysis processJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(Supp.1): 290296. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.z1.040 0 引 言石油、煤炭、天然氣等不可再生資源是當前最主要的能源物質(zhì)與化工原料，也是日益枯竭的不可再生資源1-2。因此，積極尋找可再

5、生的替代能源與化工原料，已成為迫切需要解決的問題。將數(shù)量巨大的纖維原料降解轉(zhuǎn)化為液體燃料及高值化學(xué)品具有重大的意義3-4。但是，一些限制因素阻礙了木質(zhì)纖維素生化轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟性與高效性。其中，纖維素酶應(yīng)用成本過高是制約纖維乙醇及高值化學(xué)品商業(yè)化的瓶頸因素5。纖維乙醇是大宗低價產(chǎn)品，這決定了該領(lǐng)域的纖維素酶價格必須最大限度的低廉。纖維素酶酶解的經(jīng)濟性與高效性不僅決定于菌的發(fā)酵性能及生產(chǎn)成本，也取決于纖維素的酶解體系。因此，本文圍繞纖維素酶的生產(chǎn)與酶解，討論了影響纖維素酶用酶成本的多個要素，并針對目前研究中的問題，預(yù)測了該領(lǐng)域的研究方向。 收稿日期：2015-05-09 修訂日期：2015-10-18

6、基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃（2012AA101802和2013AA065803），國家自然科學(xué)基金（21306196），廣東省科技攻關(guān)項目-工業(yè)高新技術(shù)領(lǐng)域科技計劃項目（2013B010403021）廣州市科技攻關(guān)項目（2013J4300026）作者簡介：何敏超，男，陜西合陽人，中國科學(xué)院廣州能源研究所助理研究員，碩士，主要從事纖維素酶工程方面的研究。廣州 中國科學(xué)院廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源重點實驗室，510640。 Email：hemc 通信作者：袁振宏，男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化技術(shù)開發(fā)和管理。廣州 中國科學(xué)院廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源

7、重點實驗室，510640。Email：yuanzh1 高濾紙酶活菌株的篩選、選育及工程菌構(gòu)建高活力纖維素酶菌株的發(fā)酵性能對于最終的酶解成本具有重要的決定作用。研究人員一般通過自然篩選、誘變及工程菌構(gòu)建來獲得高濾紙酶活的菌株。 1.1 產(chǎn)纖維素酶微生物的種類纖維素酶高產(chǎn)菌株主要分布于少數(shù)的幾個種屬，如木霉屬、曲霉屬、青霉屬，其它多個種屬的產(chǎn)纖維素酶菌株也有報道3,6。不過，其濾紙酶活與上述幾個種屬存在明顯的差距。自然界篩選的菌株是誘變選育及工程構(gòu)建的基礎(chǔ)，因此，積極篩選高活力纖維素酶菌株依然具有重要的應(yīng)用價值。1.2 高濾紙酶菌株的篩選自然界中，能夠產(chǎn)纖維素酶的微生物種類繁多，不過，能夠高水平產(chǎn)

8、酶的微生物種類極少7。可超高水平產(chǎn)濾紙酶活（FPA，filter paper activity）的菌株則更為稀有。從自然界篩選高活力纖維素酶的菌株，具有較大的盲目性、偶然性與隨機性。從自然界篩選高活力菌株，正確的篩選方法很關(guān)鍵。不過，正確的篩選方法只是增大了高活力菌株不被漏選的機率。更重要的則是對高活力菌株在自然界分布規(guī)律的認識。采集的樣品從根本上決定了該批次的篩選是否可以獲得高活力菌株。揭示高活力菌株在自然界的分布規(guī)律具有較大的難度。不過，Ettema C H及Sun B等指出，正是由于土壤的異質(zhì)性與多變性，使得分布其中的微生物具有可預(yù)測性及可指示性8-9。因而，以少數(shù)幾種土壤學(xué)性質(zhì)構(gòu)建一個

9、簡便、高效的指示乃至預(yù)測體系來表征高活力菌株在自然界的分布規(guī)律是可行的。增刊1 何敏超等：用于生物質(zhì)酶解過程的纖維素酶研究進展291迄今為止，從自然界篩選的濾紙酶活菌株，其液態(tài)發(fā)酵酶活范圍為：0.025.00 FPIU/mL10。絕大多數(shù)自然篩選菌株，其酶活很難高于5.00 FPIU/mL。Trichoderma reesei QM6a的濾紙酶活為0.505.00 FPIU/mL，斜臥青霉Penicillium decumbens JU-A10的誘變出發(fā)菌株P(guān). decumbens 114-2從自然界獲得時，其酶活為0.35 FPIU/mL11。Menon V從自然界篩選到超高濾紙酶活菌株，其

10、FPA高達200.00 FPIU/g12，不過，未見該菌的商業(yè)化報道。1.3 高濾紙酶菌株的選育中國纖維乙醇領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的纖維素酶依然是來自于里氏木霉Trichodema reesei Rutgers C-30與斜臥青霉Penicillium decumbens JU-A10。里氏木霉T.reesei RUC-30的液態(tài)發(fā)酵酶活在12.2057.00 FPIU/mL10,13，Penicillium decumbens JU-A10的發(fā)酵酶活在18.90 FPIU/mL14，F(xiàn)PA產(chǎn)率為160.00 FPIU/L·h。而Belghith H 15利用一株誘變的青霉進行發(fā)酵，其酶活力

11、高達23.00 FPIU/mL。這些誘變菌都借助了紫外線、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（NTG）的誘變，且經(jīng)歷了漫長的優(yōu)勢積累過程。當前，常用的高效的誘變方法是紫外線、硫酸二乙酯、NTG和亞硝基甲基脲（NMU）16。其中，NTG與NMU因為具有優(yōu)異的誘變效果而被譽為超誘變劑。利用多種誘變方法在較短的時間（12 a）獲得突破性的進展具有較大的難度。不過，采用正確的誘變技術(shù)在較短的時間里獲得階段性的成果則是有可能的。T.reesei RUC-30與Penicillium decumbens JU-A10已成為高濾紙酶活菌株選育史上的里程碑。其中，Penicillium decumbens JU

12、-A10這項科技成果獲得國家科技進步二等獎。遺憾的是，T.reesei RUC-30仍不符合纖維素乙醇的用酶要求。因此，超越這座技術(shù)高山，依然是一項既迫切又艱巨的任務(wù)?？勾x阻礙特性的菌株是獲得高活力濾紙酶活誘變菌株的重要途徑。當生物質(zhì)轉(zhuǎn)化率為75%時，纖維素酶的用酶量為1015 FPIU/g葡聚糖或者2030 mg蛋白/g葡聚糖17。2014年，李靜波18利用7.5 FPIU/g葡聚糖的酶解量時，纖維素的酶解率高達82%。也有以每加侖多少美元表征酶的應(yīng)用成本。2006年，纖維素酶應(yīng)用成本降低到2030美分/加侖乙醇。然而，纖維素酶的用酶成本還需進一步降低至34美分/加侖乙醇19。降低纖維乙醇

13、制造成本是一個系統(tǒng)的工作。不同因素所占的比重不同。如預(yù)處理的成本是0.3美元/加侖纖維乙醇20，而纖維素酶的用酶成本是0.150.30美元/加侖纖維乙醇21。多個因素相互影響，因此，降低纖維乙醇生產(chǎn)成本需要多個環(huán)節(jié)的相互協(xié)調(diào)，以更有效地降低纖維乙醇的制造成本。1.4 高濾紙酶工程菌的構(gòu)建高濾紙酶活菌株的誘變選育往往需要跨越十幾年乃至幾十年的漫長歲月。因此，誘變選育技術(shù)已經(jīng)越來越多地被基因工程、合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等日新月異的技術(shù)所替代。一般而言，將纖維素酶酶系中的某個單酶基因成功表達后，其酶活是出發(fā)菌株的幾倍乃至數(shù)百倍。但是，該重組菌濾紙酶活的提高幅度往往不大22。因此，需要將各個單酶基因分

14、別進行高效表達后再進行復(fù)配優(yōu)化以有效地提升濾紙酶活的酶解效率。2 高濾紙酶活菌株的發(fā)酵菌株最終的發(fā)酵酶活首先取決于菌株自身的特性，此外，發(fā)酵方式、發(fā)酵工藝、培養(yǎng)基成分也能夠顯著地影響最終的酶活。如：利用RUT C-30進行液態(tài)發(fā)酵，其濾紙酶活范圍為0.7857.00 FPIU/mL10，最高酶活是最低酶活的73.08倍。2.1 高濾紙酶活菌株的發(fā)酵方式不同種類的菌，其最佳的發(fā)酵方式因微生物的種類而異。里氏木霉的液態(tài)批處理補加模式明顯優(yōu)于分批發(fā)酵方式。RUT C-30在液態(tài)批處理發(fā)酵方式下，其酶活為4.9518.00 FPIU/mL10,23。在液態(tài)分批補料發(fā)酵方式下，其濾紙酶活、酶活產(chǎn)率、每克

15、干物質(zhì)濾紙酶活分別為：3010,2457 FPIU/mL，201 FPIU/L·h和226 FPIU/g發(fā)酵碳源。因此，里氏木霉RUT C-30最佳的發(fā)酵方式是液態(tài)分批補料發(fā)酵，而不是固態(tài)發(fā)酵。黑曲霉的最佳發(fā)酵方式則是固態(tài)發(fā)酵。具體的原因則需進一步的研究。此外，F(xiàn)ang X等25在采用誘變菌株Acremonium cellulolyticus strain C-1進行液態(tài)批處理發(fā)酵時，其濾紙酶活、酶活產(chǎn)率、每克干物質(zhì)濾紙酶活分別為：18.00 FPIU/mL、150.00 FPIU/L·h和360.00 FPIU/g發(fā)酵碳源。而在使用液態(tài)分批補料發(fā)酵條件下，該菌的濾紙酶活、

16、酶活產(chǎn)率、每克干物質(zhì)濾紙酶活分別為：34.60 FPIU/mL、240.30 FPIU/L·h和346.00 FPIU/g發(fā)酵碳源。濾紙酶活及酶活產(chǎn)率增幅分別為92.22%與60.20%。2.2 高濾紙酶活菌株發(fā)酵原料的預(yù)處理發(fā)酵原料的預(yù)處理方法對于最終的發(fā)酵酶活也具有重要的影響。Xin F等26利用飽和蒸汽處理后的原料進行發(fā)酵，其酶活是1%、3%氫氧化鈉處理方法酶活的3倍。而Madamwar D等27利用Aspergillus niger菌株進行固態(tài)發(fā)酵，甘蔗渣、玉米芯與鋸末預(yù)處理后的酶活是未處理酶活的3倍左右。該研究中，不同的發(fā)酵原料皆以5M NaOH處理的效果最好。Beatri

17、z M P P 使用P. echinulatum 9A02SI進行搖瓶發(fā)酵，預(yù)處理后的濾紙酶活是未處理酶活的6倍28。因此，選擇一種適宜的預(yù)處理方法對發(fā)酵原料進行預(yù)處理，可以數(shù)倍地提高濾紙酶活。2.3 在發(fā)酵體系中決定濾紙酶活高低的纖維素單酶成分在纖維素酶酶解木質(zhì)纖維素的體系中添加-葡萄糖苷酶可以顯著提升纖維素酶的酶解率29。因此，-葡萄糖苷酶被廣泛地認為是纖維素酶酶解時最關(guān)鍵的纖維素單酶30。此外，該酶也被認為是里氏木霉發(fā)酵體系中制約濾紙酶活高低的限制酶。292農(nóng)業(yè)工程學(xué)報（） 2016年在Madamwar D等研究結(jié)果27的表1中，分別以外切纖維素酶（

18、CBH）、內(nèi)切纖維素酶（EG）及-葡萄糖苷酶（BGL）與FPA進行回歸分析時發(fā)現(xiàn)，3種酶的決定系數(shù)在液態(tài)和固態(tài)條件下分別是：0.8505、0.6953、0.9416和0.9205、0.9182、0.9708；其回歸方程在液態(tài)與固態(tài)條件下分別是：y=0.8807x1.0707、y=0.4739x3.2611、y=0.7103x1.3327及=0.7237x1.5135、y=0.5942x5.3486、y=0.7199x1.0722。在固態(tài)及液態(tài)發(fā)酵條件下，BGL的決定系數(shù)都最大。這在一定程度上說明了BGL與FPA的關(guān)系最為密切。不過，在液態(tài)發(fā)酵及相同的酶活增量下，CBH對于FPA的貢獻要大于BG

19、L與EG。而在固態(tài)發(fā)酵及相同的酶活增量下，CBH對于FPA的貢獻要小于BGL。因此，較難得出究竟是哪種單酶才是決定發(fā)酵體系中FPA高低的關(guān)鍵酶。在對CBH、EG、BGL及FPA之間的關(guān)系進行大范圍地分析與歸納時，單酶對于FPU的相對重要性存在爭議。在對大量文獻中各個單酶的超高酶活進行歸納與概括時，可以看到：EG、BGL、FPA及CBH的超高酶活分別為2 358 IU/mL31，1 400 IU/mL32，57 IU/mL24及23 IU/mL33。CBH的超高酶活遠小于其它3種酶的超高酶活。因此，作者認為CBH才是現(xiàn)階段決定濾紙酶活高低的關(guān)鍵酶。Cochet N34也指出，F(xiàn)PA酶活高低與BG

20、L酶活無關(guān)，而是與CBH有關(guān)。作者對篩選分離到的數(shù)百株纖維素酶菌進行多個時間點的酶活檢測，以濾紙或羧甲基纖維素鈉為底物反應(yīng)后進行沸水浴，可觀察到刻度試管中反應(yīng)體系顏色深度的明顯增加。在以微晶纖維素為底物反應(yīng)后進行沸水浴，肉眼幾乎觀察不到顏色深度的增加。這或許在一定程度上可以解釋為什么CBH是限制FPA酶活高低的關(guān)鍵單酶因子。CBH成為制約FPA酶活高低的原因可能在于其對微晶纖維素酶解的效能較低。Cruys-Bagger N，F(xiàn)ox JM和Kurasin M等指出：CBH在沿著纖維鏈前進時，常常會因某些障礙而停止其前移的進程35-37?？梢姡珻BH是限制菌株濾紙酶活高低的關(guān)鍵酶組分。FPA是纖維

21、素酶在生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化領(lǐng)域最主要的應(yīng)用指標，因此，CBH可能是生物質(zhì)生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中最關(guān)鍵的限制性單酶因子。3 纖維素酶的酶解機理及生物質(zhì)原料的酶解影響因素纖維素酶解機理與纖維原料預(yù)處理后酶解機制的認識不僅有利于降低纖維素酶的用酶成本，而且對于纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選、選育、構(gòu)建及纖維素酶蛋白質(zhì)工程優(yōu)化都具有積極的指導(dǎo)意義。 3.1 纖維素酶的酶解機理當前，普遍接受的酶解機理是CBH、EG與BGL協(xié)同作用降解微晶纖維素。已有研究人員對多個纖維素酶的協(xié)同作用開展了深入的研究。Igarashi采用原子力顯微鏡（atomicforce microscope，AFM）技術(shù)來研究CBHI與CBHII之間的

22、協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)同時加入2種酶所產(chǎn)生的纖維二糖總量要高于2種酶分子各自產(chǎn)糖量的簡單加合38。Wang等利用AFM技術(shù)研究CBHI、CBHII和EGI三種酶不同的加入順序，其協(xié)同程度因加入順序而異39?，F(xiàn)在，CBHI酶解結(jié)晶纖維素的過程被假設(shè)為6步，具體為36,40-41：a）CBHI通過CBM吸附于微晶纖維素表面，b）CBHI在纖維表面擴散、通過催化中心發(fā)現(xiàn)并識別纖維素鏈末端，而后形成酶-微晶纖維素復(fù)合物，c）纖維素鏈穿線于活性位點通道并形成生產(chǎn)型的酶-底物復(fù)合物，d）糖苷鍵的水解，e）釋放纖維二糖，f）下一個纖維二糖單位的穿入并再次形成生產(chǎn)型復(fù)合物。步驟d與f不斷循環(huán)直到復(fù)合物的解聚或者遇到阻

23、礙物。借助于蛋白純化、基因突變、Hs-AFM等技術(shù)手段，已經(jīng)就酶解機理與酶解過程展開了分子水平上的研究42。如：活性通道與起始反應(yīng)有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸43、纖維素結(jié)合通道對于纖維素鏈末端的起始反應(yīng)44、預(yù)穩(wěn)態(tài)35以及該酶解起始反應(yīng)與可持續(xù)性反應(yīng)的限速因子36。深入研究酶解過程中的限速反應(yīng)及該限速反應(yīng)的形成機制，可以為高比活力CBH蛋白質(zhì)工程優(yōu)化指明方向，也可為酶解體系優(yōu)化，降低纖維素酶用酶成本提供理論依據(jù)。 3.2 木質(zhì)纖維素酶解效率的影響因素生物質(zhì)酶解效率不僅僅取決于酶的可及性與高效性，也與生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征密不可分。生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征可分為化學(xué)的與物理的?；瘜W(xué)特征指的是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及結(jié)

24、合于半纖維素之上的乙?；鶊F。物理特征指的是表面積、可及性、結(jié)晶度、生物基質(zhì)中木質(zhì)素的分布、聚合度、孔容積與粒徑。一種結(jié)構(gòu)特性的變化會導(dǎo)致其它結(jié)構(gòu)特性的變化。此外，生物質(zhì)的異質(zhì)性與酶的多樣性使得充分理解酶與底物的相互作用顯得比較困難。因此，在確定生物質(zhì)預(yù)處理后限速反應(yīng)的關(guān)鍵影響因子時存在較大的難度45。限速反應(yīng)的關(guān)鍵影響因素可能是幾個生物質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的綜合46。3.2.1 微晶纖維素酶解過程中的關(guān)鍵纖維素酶組分Wang等利用Trichoderma pseudokoningii S-38的纖維素酶來酶解經(jīng)過除蠟去脂處理的棉纖維47。研究者觀察到CBHs的酶活在第2天及第4天時分別下降為起始酶活的50

25、%和15%。在相同的酶解體系中，EG在10d之后才降為起始酶活的50%，此后該酶以緩慢的速率持續(xù)降低。FPA與BGL的酶活降低趨勢與EG相似，不過，F(xiàn)PA在后期酶活降低的速度比EG和BGL該文中可以看到，只有CBH的相對酶活總是低于FPA的相對酶活。因此，Wang認為，F(xiàn)PA活力的降低主要歸因于CBHs酶活力的降低。由于FPA代表著纖維素酶的糖化力，因此，CBHs酶活力的降低才是纖維素酶解速率降低的主要因素。不過，該研究采用的是棉纖維，因此，預(yù)處理后生物質(zhì)酶解過程中的關(guān)鍵纖維素酶組分依然需要采用生物質(zhì)來檢測。3.2.2 纖維素結(jié)晶度、晶型對于纖維素酶解的影響生物質(zhì)預(yù)處理后，纖維素結(jié)晶體的聚集狀

26、態(tài)（晶型）會發(fā)生變化。纖維素晶型的變化可能是生物質(zhì)可酶解性提升的主要因素。增刊1 何敏超等：用于生物質(zhì)酶解過程的纖維素酶研究進展2932006年，Igarashi采用來源于里氏木霉的Cel7A（CBH I）酶解不同晶型的纖維素，該酶對晶型Ia的酶解活性是晶型I的2倍48。采用水熱處理將Ia轉(zhuǎn)化為I后，Cel7A對其酶解活力與天然纖維素的I就是說，吸附態(tài)Cel7A的酶解活力決定于微晶纖維素的晶型。表面強度與特異活性清楚地表明，Ia更高的降解度主要是由于Ia具有更高的酶特異活性而不是由于更大的表面積。更深層次的原因可能是由于Ia與I對于Cel7A 的CBD 或CD存在著空間位阻的差異。2007年，

27、Igarashi在利用來源于里氏木霉的Cel7A進行酶解時，盡管吸附于纖維素I 上的纖維素酶量是纖維素IIII酶量的2倍多，而纖維素IIII酶解后纖維二糖的產(chǎn)量是纖維素I的5倍多，并且纖維素IIII上的Cel7A特異活性3倍多地高于纖維素I49。采用水熱處理將纖維素IIII轉(zhuǎn)化為I后，纖維二糖的產(chǎn)量顯著下降。這表明，纖維素IIII提高的酶解率與纖維素晶型結(jié)構(gòu)有關(guān)。纖維素的起始結(jié)晶度在酶解反應(yīng)中發(fā)揮著主要的限速作用。不過，很難得出結(jié)晶度是酶解速率的關(guān)鍵決定因素。隨著結(jié)晶度的增加，結(jié)晶度與起始酶解率的相關(guān)性持續(xù)下降。在較高的結(jié)晶度下，纖維素樣品的酶解活性更低，酶解可及性更小。纖維素的結(jié)晶度與可及性

28、緊密相關(guān)50。廣泛認可的是，相較于無定型纖維素，高度結(jié)晶化的纖維素，其可及性更低。因此，結(jié)晶度與酶解效率負相關(guān)45。不過，Kim的結(jié)論與之相反51。去木質(zhì)素后，纖維素結(jié)晶度從43%增加到60%，然而，增加的結(jié)晶度并沒有降低酶解第3天的糖產(chǎn)量。大量地去除木質(zhì)素后可以得到高的降解度。而該降解度與乙酰基團以及結(jié)晶度無關(guān)。因此，結(jié)晶度可以顯著的影響起始的酶解速率，對于最終糖產(chǎn)量的作用較小。3.2.3 木質(zhì)素對于纖維素酶解的影響木質(zhì)素被認為是酶蛋白攻擊纖維素的主要空間阻礙物，因為木質(zhì)素與纖維素微纖絲緊密相連而降低木質(zhì)纖維素酶的可及性。通過去除木質(zhì)素可以提高生物質(zhì)的可降解性。去除木質(zhì)素后，可以促進生物質(zhì)的

29、溶脹、促使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的斷裂，增加內(nèi)部的接觸面與孔容積，降低木質(zhì)素對于纖維素酶的不可逆吸附，增大纖維素的酶解可及度45。Kumar的研究結(jié)果表明，在纖維素酶較低的蛋白添加量（5 FPA/g cellulose）下，木質(zhì)素成分能夠顯著地影響纖維素的溶脹程度與可及度，在此情況下，僅有16%的纖維素被酶解。該底物進一步去除木質(zhì)素后，纖維素則幾乎完全酶解52。在較低的纖維素酶添加量下，木質(zhì)素降低糖產(chǎn)量主要是因為限制酶的可及性與非生產(chǎn)型結(jié)合。不過，當木質(zhì)素未限制纖維素的膨脹與和酶的可及性時，纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附作用對于酶解的影響作用降低。在纖維素的可及度提高后，即使在高濃度的木質(zhì)素下，依然能夠得到

30、良好的酶解效率。 3.3 添加非纖維素酶的多酶體系的優(yōu)化添加非纖維素酶組分的酶蛋白，如非水解酶蛋白AA9（auxiliary activity family 9）、木聚糖酶等，可以顯著地促進纖維素的酶解率，從而大幅度地降低用酶成本。 3.3.1 非水解蛋白對于纖維原料酶解的促進作用AA9現(xiàn)在被認為是具有木質(zhì)纖維素酶活力的酶蛋53白。AA9之前被命名為蛋白GH61。AA9蛋白可以7倍之巨地降低玉米秸稈預(yù)處理后纖維素酶的用酶成本54。由此可見，積極探索新的非水解蛋白具有重要的意義。研究人員已圍繞AA9蛋白的多樣性、反應(yīng)機理、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及該蛋白的基因表達展開了研究。該酶的酶解機理不同于纖維素酶

31、及半纖維素酶的水解活性，而是一種裂解活性。AA9酶基因幾乎存在于所有的產(chǎn)纖維素酶真菌，并與纖維素酶、半纖維素酶及其它輔酶共處于同一個調(diào)節(jié)系統(tǒng)。此外，擴張蛋白（Expansins）及膨脹素（Swollenin）也能夠增強纖維素酶的酶解55。其機理可能是擴張蛋白能夠打斷氫鍵而降低了纖維素的結(jié)晶度并最終增加了纖維素的可及性。3.3.2 纖維素酶與木聚糖酶之間的酶系優(yōu)化木聚糖在纖維素酶作用于纖維素時形成了一定的空間位阻效應(yīng)56，而木寡糖對于纖維素酶具有一定程度的抑制作用57-59EGII, CBHI和CBHII并最終顯著地地降低葡萄糖的產(chǎn)率57,59。60Hu J等以木聚糖酶的補加方式及部分替代方式來

32、研究該酶對于纖維素酶酶解效果的影響。在補加方式中，35 mg的纖維素酶+60 mg的木聚糖酶獲得最高的纖維素及木聚糖水解率，分別為87.1%與100%，2種酶的協(xié)同系數(shù)為1.02。在部分替代方式中，5 mg的纖維素酶+30 mg的木聚糖酶獲得最佳的纖維素及木聚糖水解率，分別為82.3%與98.6%。此時，木聚糖酶替代纖維素酶的蛋白量高達86%，2種酶的協(xié)同系數(shù)為1.62。由此可見，采取適當?shù)奶砑臃绞脚c適宜的木聚糖酶添加量，可以大幅度地降低纖維素酶的用量。Li J等18以氫氧化鈉、硫酸、雙氧水及蒸汽爆破的方法對甘蔗渣進行預(yù)處理，然后以纖維素酶與木聚糖酶進行混合酶解。在保持纖維素酶與木聚糖酶酶蛋白

33、總量不變的情況下酶解氫氧化鈉預(yù)處理原料，4份纖維素酶+1份木聚糖酶所產(chǎn)的葡萄糖量遠高于全纖維素酶的葡萄糖產(chǎn)量，即木聚糖酶可以替代20%的纖維素酶。該研究還指出，木聚糖酶與纖維素酶的協(xié)同程度與木聚糖含量、酶解時間有關(guān)。而且，預(yù)處理方法可以顯著影響2種酶的協(xié)同作用。4 總 結(jié)1）外切纖維素酶（circumscribed cellulose, CBH）可能是發(fā)酵體系中決定濾紙酶活（filter paper activity, FPA）高低的關(guān)鍵因子，同時，也可能是酶解預(yù)處理后木質(zhì)纖維素體系中決定FPA效率的關(guān)鍵因子。纖維乙醇領(lǐng)域中，F(xiàn)PA是纖維素酶最重要的應(yīng)用指標，因此，CBH可能是決定生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)

34、化領(lǐng)域纖維素酶解效率經(jīng)濟性與高效性最關(guān)鍵的限制酶。CBH之所以成為限制FPA高低的關(guān)鍵因子，仍需在分子水平上對于酶解機理進行深入的研究。294農(nóng)業(yè)工程學(xué)報（） 2016年P(guān)rogress in Energy and Combustion Science, 2012, 38(4): 522550.13 Mclean D D, Abear K, Podruzny M F. Fed-batch productionof cellulase using Thichoderma reesei Rutgers C-30J. The canadian journal o

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42、 2010, 162(1): 295306.27 Madamwar D, Patel S, Parikh H. Solid State Fermentation forCellulases and -Glucosidase Production by Aspergillus2）當前，中國的研究人員在纖維素酶的基因表達、表達載體的改造及優(yōu)良宿主菌的構(gòu)建方面已經(jīng)取得一定的進展，但尚未獲得商業(yè)化的成果。國外公司如諾維信等生產(chǎn)的混合纖維素酶依然不能夠滿足生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的用酶要求。3）需要借助Hf-AFM技術(shù)來進一步研究分子水平的木質(zhì)纖維素酶解機理、酶解過程中的限速反應(yīng)以及該限速反應(yīng)的形成機制。揭示

43、限速反應(yīng)的形成機制和限速反應(yīng)的關(guān)鍵因素，可以為高比活力纖維素酶的蛋白質(zhì)工程優(yōu)化提供理論支撐。4）利用多種手段來揭示自然界木質(zhì)纖維素腐解的限速反應(yīng)也具有重要的理論意義。參 考 文 獻1 孫永明，袁振宏，孫振鈞. 中國生物質(zhì)能源與生物質(zhì)利用現(xiàn)狀與展望J. 可再生能源，2006，162(2)：7882.Sun Yongmin, Yuan Zhenhong, Sun Zhenjun. The status and future of bioenergy and biomass utilization in ChinaJ. Renewable energy, 2006, 126(2): 7882. (i

44、n Chinese with English abstract)2 Wilson D B. Cellulases and biofuelsJ. Current opinion inbiotechnology, 2009, 20(3): 295299.3 Gusakov A V. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuelproductionJ. Trends in biotechnology, 2011, 29(9): 419425.4 曲音波. 纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化J. 化學(xué)進展，2007，19(7/8)：10981108.Qu Yinbo. In

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