琥珀酸發(fā)酵研究進(jìn)展

1、發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸研究進(jìn)展天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院張張 健健The approach of succinic acid fermentationContents1. Introduction 2. Succinic acid markets and applications3. Succinic acid producers4. Recovery of succinic acid 5. Conclusions and future prospects1、Introduction 琥珀酸(succinic acid)，學(xué)名為丁二酸butanedioic acid)，最初在15

2、46年由Gerogius Agricola從琥珀中分離發(fā)現(xiàn)，故而得名。琥珀酸是一種四碳二羧酸，n分子式為C4H6O4，分子量為118.09，n廣泛地存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。n琥珀酸是生物代謝過(guò)程中三梭酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，n同時(shí)也是一些厭氧微生物的代謝終產(chǎn)物。 純凈的琥珀酸為無(wú)色單斜棱柱狀結(jié)晶體，味酸，可燃。有二種晶形(型和型)， 型在137以下穩(wěn)定，而型在137以上穩(wěn)定。在熔點(diǎn)以下加熱時(shí)，丁二酸升華，脫水生成丁二酸酐。熔點(diǎn)188，沸點(diǎn)235 (分解)，相對(duì)密度為1.572。溶于水、乙醇和乙醚；不溶于氯仿、二氯甲烷，微溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和石油醚。(4)與胺類(lèi)化合物反應(yīng)，制得琥珀酸

3、亞胺。(5)氧化作用：琥珀酸以H2O2氧化為過(guò)氧琥珀酸(CH2COOOH)2。在KMnO4作用下生成草酸、羥基琥珀酸和酒石酸的混和物。(6)還原作用：琥珀酸(配)在催化劑作用下還原為1，4-丁二醇和四氫呋喃(7)與S03反應(yīng)，琥珀酸與S03反應(yīng)，生成2，3-二磺酸基琥珀酸。(8)Friedel-Caraft反應(yīng)，合成血液中的粒子阻聚劑3-(4-聯(lián)苯羰基)丙酸。2. Succinic acid markets and applications（1）琥珀酸在食品行業(yè)的主要應(yīng)用：琥珀酸是一種理想的酸味劑，肉罐頭等的風(fēng)味增強(qiáng)劑，餅干的強(qiáng)化劑。（2）琥珀酸在醫(yī)藥行業(yè)的主要應(yīng)用：琥珀酸可以用做防腐劑，pH

4、調(diào)節(jié)劑，助溶劑；還可以用來(lái)合成解毒劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、停止血藥、合成抗生素以及維生素A、B 等。（3）琥珀酸在化學(xué)工業(yè)的主要應(yīng)用：作為離子螯和劑，用于在電鍍行業(yè)防止金屬的溶蝕和點(diǎn)蝕。（4）琥珀酸是一種良好的表面活性劑，（ 5）琥珀酸可生產(chǎn)脫毛劑（6）琥珀酸還用于潤(rùn)滑劑（7）琥珀酸還被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中處理種子以提高發(fā)芽率，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。還用來(lái)處理大麥黑穗病，用作除草劑的添加劑。（8）琥珀酸可作為小豬和其它單胃動(dòng)物的緩沖物和能量來(lái)源。（9）作為一種四碳平臺(tái)化合物能夠取代很多基于苯和石化中間產(chǎn)物的商品而作為許多重要的中間產(chǎn)物和大宗化學(xué)制品。美國(guó)能源部2004 年發(fā)布的報(bào)告中(www. eere. en

5、ergy. Gov/biomass/pdfs/35523) 將琥珀酸列為12 種最有潛力大宗生物基化學(xué)品中的第一位。琥珀酸為基礎(chǔ)的化學(xué)制品琥珀酸為基礎(chǔ)的化學(xué)制品 a. 琥珀酸的結(jié)構(gòu)是飽和的二羧酸可以轉(zhuǎn)化為1，4-丁二醇、四氫呋喃、-丁內(nèi)酯和其它四碳的化學(xué)制品。b. 將琥珀酸轉(zhuǎn)化成這些中間化學(xué)制品的化學(xué)催化技術(shù), 已經(jīng)取得了重要的發(fā)展。例如，琥珀酸可以容易地氫化成1，4-丁二醇，然后還可以進(jìn)一步碳基化成已二酸。c. 琥珀酸衍生的最有潛力的產(chǎn)品包括：N-甲基吡咯烷酮（NMP），1，4-丁二醇（BDO），已二酸，順丁烯二酸酐，富馬酸和蘋(píng)果酸。N-甲基吡咯烷酮甲基吡咯烷酮: 可替代二氯甲烷作為一種溶劑

6、，由于它比二氯甲烷揮發(fā)性小很多，因此能回收使用而不會(huì)將有毒物質(zhì)排放到大氣中。此市場(chǎng)潛在容量超過(guò)100萬(wàn)噸/年。1，4-丁二醇（丁二醇（BDO）：）：是生產(chǎn)聚酯樹(shù)脂（PBT）工程塑料的主要原料。而PBT廣泛應(yīng)用于電子電器元件和零部件及汽車(chē)工業(yè)中。BDO在聚氨酯方面應(yīng)用主要是制備皮革、鞋底材料、彈性材料等。2006年全球BDO的需求量超過(guò)80萬(wàn)噸，國(guó)內(nèi)主要依賴于進(jìn)口價(jià)格在10400-12100人民幣/噸之間波動(dòng)。已二酸：已二酸：是生產(chǎn)尼龍和聚氨酯的主要原料之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)2006年全球需求量為227萬(wàn)噸，產(chǎn)能達(dá)到280萬(wàn)噸。由于其生產(chǎn)方法主要為環(huán)己烷法和苯酚法，受到國(guó)際原油價(jià)格的影響，價(jià)格在10000

7、-12000人民幣/噸波動(dòng)。順丁烯二酸酐：順丁烯二酸酐：又名順酐 、馬來(lái)酸酐是重要的有機(jī)化工原料，與苯酐、醋酐并列為三大酸酐，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。2006年全球總產(chǎn)能超過(guò)140萬(wàn)噸。我國(guó)有30多家生產(chǎn)廠，目前市場(chǎng)價(jià)格在6250-7900人民幣/噸波動(dòng)。蘋(píng)果酸：蘋(píng)果酸：具有優(yōu)良生理功能的酸味劑，全球L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量?jī)H為3萬(wàn)噸/年，而需求量則為8.5萬(wàn)噸/年。 N-甲基吡咯烷酮甲基吡咯烷酮主要由-丁內(nèi)酯生產(chǎn)。 1，4-丁二醇丁二醇90%是以乙炔和甲醛生產(chǎn)； 已二酸已二酸主要由環(huán)己烷氧化法生產(chǎn)； 順丁烯二酸酐順丁烯二酸酐主要由苯法或正丁烷法生產(chǎn)； -丁內(nèi)酯丁內(nèi)酯主要由1，4-丁二醇或順丁烯二酸酐生產(chǎn)； 琥珀

8、酸琥珀酸全部由石化法生產(chǎn)； 粗略考慮各種產(chǎn)品的相互轉(zhuǎn)化，琥珀酸的總潛在用量大約為超過(guò)400萬(wàn)噸。 從表中分析可知，發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的成本7221.5元/噸與傳統(tǒng)的石化法臨界成本12526元/噸相比具有一定的競(jìng)爭(zhēng)力，應(yīng)加大對(duì)琥珀酸向-丁內(nèi)酯和蘋(píng)果酸的研究。 而對(duì)于琥珀酸衍生物的大宗化工原料市場(chǎng)，和石化法相比生物轉(zhuǎn)化法成本處于劣勢(shì)。必需進(jìn)一步降低其成本到5749元/噸和3499元/噸，才能夠極大的促進(jìn)琥珀酸向丁二醇和己二酸的轉(zhuǎn)變應(yīng)用，從而使琥珀酸進(jìn)入全球大宗商品的行列。 如果能進(jìn)一步降低成本到3066元/噸，接近其理論最低成本時(shí)其市場(chǎng)份額能夠進(jìn)一步擴(kuò)大，總量將超過(guò)400萬(wàn)噸。琥珀酸的成本必須降低到

9、US$0.45 /公斤（3735元/噸） 技術(shù)進(jìn)步對(duì)成本的影響技術(shù)進(jìn)步對(duì)成本的影響 工廠的初始成本為工廠的初始成本為$0.86/Kg，采用濕磨玉米粉為原料時(shí)，成本降低到，采用濕磨玉米粉為原料時(shí)，成本降低到S$0.75/Kg；發(fā)酵菌種的產(chǎn)酸速率由發(fā)酵菌種的產(chǎn)酸速率由2.3提高到提高到4.0g/l/h，成本降低到，成本降低到US$0.58/Kg；在分離過(guò)程中，成本能夠降低到在分離過(guò)程中，成本能夠降低到US$0.64/Kg；規(guī)模經(jīng)濟(jì)成本繼續(xù)下降。規(guī)模經(jīng)濟(jì)成本繼續(xù)下降。最后其預(yù)測(cè)理想的最低成本為最后其預(yù)測(cè)理想的最低成本為US$0.27/Kg，約，約2241元元/噸。噸。琥珀酸的化學(xué)合成法琥珀酸的化學(xué)合

10、成法 1石蠟氧化法。 石蠟在鈣、錳催化下氧化得到混合二元酸氧化石蠟，后者經(jīng)過(guò)熱水蒸汽蒸餾，去除不穩(wěn)定羥基油性酸及酯，水相含有琥珀酸，經(jīng)過(guò)除水得到琥珀酸的結(jié)晶。 此法是傳統(tǒng)生產(chǎn)丁二酸的方法，生產(chǎn)工藝比較成熟， 但產(chǎn)率純度都不高。石蠟石蠟二元酸氧化石蠟二元酸氧化石蠟琥珀酸琥珀酸鈣、錳鈣、錳蒸汽蒸餾蒸汽蒸餾 2順，反丁烯二酸加氫法 順，反丁烯二酸在催化劑作用下加氫反應(yīng)，生成琥珀酸，然后分離得到成品。反應(yīng)的催化劑為鎳以及其他一些貴金屬，反應(yīng)溫度約為130-140oC。 此法轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)率高，無(wú)明顯的副反應(yīng)，產(chǎn)物質(zhì)量良好，但操作條件較高，使用催化劑價(jià)格昂貴。鎳鎳 130-1403.電化學(xué)合成法 通過(guò)電解

11、，在陰極上順丁烯二酸烯鍵加成，發(fā)生還原反應(yīng)生成丁二酸，陽(yáng)極電解出的H+提供給陰極 此法生產(chǎn)條件溫和，收率高、純度高，設(shè)備簡(jiǎn)單，無(wú)三廢污染，是一種新工藝，但還有許多問(wèn)題需要解決，如電耗大，離子膜易破、陽(yáng)極消耗嚴(yán)重、工藝操作條件不佳等。其它方法： 環(huán)烷酸在釩催化作用下與HNO3反應(yīng)生產(chǎn)琥珀酸。 環(huán)烯的臭氧（或H2O2）氧化，糠醛的H2O2氧化，-丁烯氣相催化氧化法制得琥珀酸。 丙烯、NaCN和H2O的混合物用鈀催化熱壓法制得琥珀酸鹽。 馬來(lái)酸電解還原法等。琥珀酸的生物轉(zhuǎn)化法及其優(yōu)勢(shì)琥珀酸的生物轉(zhuǎn)化法及其優(yōu)勢(shì)所謂生物轉(zhuǎn)化法就是利用細(xì)菌或其他微生物發(fā)酵的方法以淀粉，糖或其他微生物能夠利用的廢料為原料生

12、產(chǎn)琥珀酸及其衍生物。一般認(rèn)為生物轉(zhuǎn)化法具有以下優(yōu)點(diǎn)：一般認(rèn)為生物轉(zhuǎn)化法具有以下優(yōu)點(diǎn)：原料成本低廉，并可再生。原料成本低廉，并可再生。發(fā)酵過(guò)程可吸收二氧化碳，綠色環(huán)保。發(fā)酵過(guò)程可吸收二氧化碳，綠色環(huán)保。節(jié)約大量的能源節(jié)約大量的能源1原料成本低廉，并可再生石化法生產(chǎn)琥珀酸石油這種不可再生的自然資源價(jià)格越來(lái)越貴生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生大量的有毒、有害產(chǎn)品。發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸主要來(lái)原料來(lái)源-玉米。直接液化玉米粉的方法來(lái)制備發(fā)酵培養(yǎng)基。歐洲和美洲過(guò)剩的乳清產(chǎn)品也是生產(chǎn)琥珀酸的良好碳源。以垃圾或造紙等行業(yè)的廢料為原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。2發(fā)酵過(guò)程可吸收二氧化碳，綠色環(huán)保。 生物轉(zhuǎn)化法一般能夠在發(fā)酵過(guò)程中，固定大量的二氧化碳

13、氣體。 每生產(chǎn)一公斤琥珀酸，將會(huì)有0.37公斤的二氧化碳被固定。 將此生產(chǎn)過(guò)程和發(fā)酵乙醇的生產(chǎn)過(guò)程相連將非常有利于對(duì)乙醇發(fā)酵的二氧化碳副產(chǎn)物的綜合利用，減少溫室氣體的排放。3節(jié)約大量的能源 運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化法將節(jié)約大量的石油資源。根據(jù)美國(guó)能源部的信息，琥珀酸此項(xiàng)產(chǎn)品每年能夠節(jié)約大約1.034x1016J的能源。這將大大緩解現(xiàn)今社會(huì)的能源大量短缺，減少不可再生資源的消耗。3. Succinic acid producers（1）產(chǎn)琥珀酸的微生物種類(lèi)）產(chǎn)琥珀酸的微生物種類(lèi)（2）產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌）產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（3）產(chǎn)琥珀酸放線桿菌）產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（4）大腸桿菌）大腸桿菌（5）耗氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸）耗

14、氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸（1）產(chǎn)琥珀酸的微生物種類(lèi)）產(chǎn)琥珀酸的微生物種類(lèi) 琥珀酸是一些厭氧和兼性厭氧微生物代謝途徑中的共同中間物。琥珀酸是一些厭氧和兼性厭氧微生物代謝途徑中的共同中間物。丙酸鹽生產(chǎn)菌例如丙酸鹽生產(chǎn)菌例如Propionibacterium species, 典型的胃腸細(xì)菌例如典型的胃腸細(xì)菌例如Escherichia coli, Pectinatus sp., Bacteroides sp.瘤胃細(xì)菌例如瘤胃細(xì)菌例如 Ruminococcus favefaciens,乳酸菌（乳酸菌（Lactobacillus）也能在特定的培養(yǎng)基上不同程度地產(chǎn)生琥珀酸。）也能在特定的培養(yǎng)基上不同程度地產(chǎn)生琥珀

15、酸。其他已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的產(chǎn)琥珀酸菌還有：其他已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的產(chǎn)琥珀酸菌還有：梭菌屬細(xì)菌梭菌屬細(xì)菌Clostridium thermosuccinogens（產(chǎn)琥珀酸嗜熱梭狀芽孢桿菌），（產(chǎn)琥珀酸嗜熱梭狀芽孢桿菌），腸球菌屬腸球菌屬Enterococcus faecalis（糞腸球菌），（糞腸球菌），沃林菌屬沃林菌屬Wolinella succinogenes（產(chǎn)琥珀酸沃林桿菌產(chǎn)琥珀酸沃林桿菌）, 囊菌亞門(mén)真菌囊菌亞門(mén)真菌Claviceps purpurea（紫斑麥角菌），（紫斑麥角菌），硫螺菌硫螺菌 Sulfurospirillum sp.（硫磺螺菌）（硫磺螺菌）。產(chǎn)琥珀酸的微生物產(chǎn)琥珀酸的微生物目前主要

16、的研究集中在：目前主要的研究集中在：產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniproducens）產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)大腸桿菌（大腸桿菌（Escherichia coli）（2）產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌）產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniproducens ）來(lái)源：小獵犬的口腔來(lái)源：小獵犬的口腔革蘭氏陰性嚴(yán)格厭氧菌革蘭氏陰性嚴(yán)格厭氧菌碳源：葡萄糖、乳糖為碳源：葡萄糖、乳糖為主產(chǎn)物：琥珀酸和乙酸，主產(chǎn)物：琥珀酸和乙酸，同

17、時(shí)生成少量：甲酸、乙醇、乳酸。同時(shí)生成少量：甲酸、乙醇、乳酸。即以氫為還原劑的摩爾最大產(chǎn)率為即以氫為還原劑的摩爾最大產(chǎn)率為2mol琥珀酸琥珀酸/mol葡萄糖，轉(zhuǎn)化率葡萄糖，轉(zhuǎn)化率131%。 Samuelov等人的研究結(jié)果表明，在最適條件下，等人的研究結(jié)果表明，在最適條件下，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的產(chǎn)率可以達(dá)到產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的產(chǎn)率可以達(dá)到120mol/100mol。最高濃度為。最高濃度為65g/L。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌代謝途徑產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌代謝途徑磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 蘋(píng)果蘋(píng)果酸脫氫酶酸脫氫酶 延胡酸還原酶延胡酸還原酶丙酮酸丙酮酸激酶激酶 丙酮酸脫氫酶系丙酮酸脫氫酶系 磷酸轉(zhuǎn)磷

18、酸轉(zhuǎn)乙?；敢阴；敢掖济摎涿敢掖济摎涿戈P(guān)鍵性酶：關(guān)鍵性酶：PEP羧激酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、富馬酸酶、富馬酸脫羧激酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、富馬酸酶、富馬酸脫氫酶氫酶CO2濃度控制濃度控制PEP的流向：的流向：低低CO2濃度濃度-10mol CO2 /100mol 葡萄糖，產(chǎn)物為葡萄糖，產(chǎn)物為乳酸乳酸高高CO2濃度濃度-100mol CO2 /100mol 葡萄糖，主產(chǎn)葡萄糖，主產(chǎn)物琥珀酸，僅產(chǎn)生微量乳酸物琥珀酸，僅產(chǎn)生微量乳酸pH6.2、高、高CO2濃度濃度-琥珀酸產(chǎn)量琥珀酸產(chǎn)量35g/L,65%葡萄葡萄糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸。糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸。PEP羧激酶羧激酶PEP羧激酶被分離純化羧激酶被分離純化在在Mn2+

19、、Co2+、Mg2+、存在時(shí)表現(xiàn)最大活力、存在時(shí)表現(xiàn)最大活力對(duì)編碼對(duì)編碼PEP羧激酶的基因羧激酶的基因pckA進(jìn)行了克隆、發(fā)現(xiàn)產(chǎn)琥進(jìn)行了克隆、發(fā)現(xiàn)產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的珀酸厭氧螺菌的PEP羧激酶的基因與大腸桿菌的具有羧激酶的基因與大腸桿菌的具有67.3%的同源性。的同源性。但在大腸桿菌中成功表達(dá)后卻并未導(dǎo)致琥珀酸的產(chǎn)量但在大腸桿菌中成功表達(dá)后卻并未導(dǎo)致琥珀酸的產(chǎn)量升高。升高。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌具有以下發(fā)酵特性：產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌具有以下發(fā)酵特性：可以利用的發(fā)酵底物廣泛：葡萄糖、乳糖、甘油?？梢岳玫陌l(fā)酵底物廣泛：葡萄糖、乳糖、甘油。山梨糖醇促進(jìn)代謝向產(chǎn)琥珀酸的方向。山梨糖醇促進(jìn)代謝向產(chǎn)琥珀酸的方向。厭

20、氧發(fā)酵過(guò)程中，通入?yún)捬醢l(fā)酵過(guò)程中，通入CO2對(duì)琥珀酸的代謝具有關(guān)鍵對(duì)琥珀酸的代謝具有關(guān)鍵的作用，通入的作用，通入H2有利于琥珀酸的產(chǎn)生，最優(yōu)有利于琥珀酸的產(chǎn)生，最優(yōu)CO2/ H2比例一般在比例一般在95：5。不能耐受高滲透壓，葡萄糖濃度在不能耐受高滲透壓，葡萄糖濃度在20-80g/L之間，之間，而且不能耐受高濃度的琥珀酸鹽。而且不能耐受高濃度的琥珀酸鹽。發(fā)酵發(fā)酵pH在在5.8-6.6，發(fā)酵主要副產(chǎn)物為乙酸。發(fā)酵主要副產(chǎn)物為乙酸。nGlassner等人以產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（等人以產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniproducens ATCC53488）為發(fā)酵菌株

21、，以糖為底物在）為發(fā)酵菌株，以糖為底物在培養(yǎng)基中添加不到培養(yǎng)基中添加不到1%的氮源和不到的氮源和不到10ppm的硫離子發(fā)酵琥的硫離子發(fā)酵琥珀酸的產(chǎn)率達(dá)到珀酸的產(chǎn)率達(dá)到70%以上，并有大約以上，并有大約20%的乙酸副產(chǎn)物。的乙酸副產(chǎn)物。nGuettler 等人以產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（等人以產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniproducens ATCC29035）為出發(fā)菌株，通過(guò)篩選得到）為出發(fā)菌株，通過(guò)篩選得到了比出發(fā)菌株更耐單氟乙酸鈉的自發(fā)突變株了比出發(fā)菌株更耐單氟乙酸鈉的自發(fā)突變株FA-10（ATCC55617）。此菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中琥珀酸）。此菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中

22、琥珀酸/乙酸的比例乙酸的比例由大約由大約4：1提高到提高到80：1。此菌株對(duì)初始糖濃度最高耐受濃。此菌株對(duì)初始糖濃度最高耐受濃度為度為60g/L，最優(yōu)初始糖濃度為，最優(yōu)初始糖濃度為30g-50g/L。n在最優(yōu)發(fā)酵條件下琥珀酸的產(chǎn)量可以超過(guò)在最優(yōu)發(fā)酵條件下琥珀酸的產(chǎn)量可以超過(guò)30g/L,轉(zhuǎn)化率超過(guò)轉(zhuǎn)化率超過(guò)70%，并有一定程度的丙酮酸積累。，并有一定程度的丙酮酸積累。 （2）產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes ) 來(lái)源：牛胃中分離得到，兼性厭氧菌。 革蘭氏陰性菌株，經(jīng)16 SrRNA鑒定為巴斯德菌科放線桿菌屬。 能夠利用多種碳源：樹(shù)膠醛糖、纖

23、維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、山梨糖醇、蔗糖、木糖或水楊苷。 并能夠耐受高濃度的琥珀酸鹽，對(duì)高濃度的葡萄糖有較好的耐受性。 葡萄糖為底物時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸，乙酸和少量的甲酸和乙醇。 一般認(rèn)為產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌,產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的琥珀酸合成途徑基本相同。 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 蘋(píng)果酸脫氫酶蘋(píng)果酸脫氫酶 延胡羧酸酶延胡羧酸酶 延胡酸還延胡酸還原酶原酶 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 丙酮酸脫氫酶系丙酮酸脫氫酶系 磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶磷酸轉(zhuǎn)乙?；敢宜峒っ敢宜峒っ?檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 丙酮酸丙酮酸- -甲酸裂合酶甲酸裂合酶 蘋(píng)果酸酶蘋(píng)果

24、酸酶 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)代謝途徑代謝途徑12五種產(chǎn)琥珀酸關(guān)鍵酶五種產(chǎn)琥珀酸關(guān)鍵酶：PEP羧化激酶羧化激酶(pck)、蘋(píng)果酸脫氫酶蘋(píng)果酸脫氫酶(mdh)、蘋(píng)果酸酶蘋(píng)果酸酶(sfc)、延胡索酸酶延胡索酸酶(fum)延胡索酸還原酶延胡索酸還原酶(frd)。丙酮酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸激酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶的存在，將乳酸脫氫酶的存在，將會(huì)影響中心代謝途徑分析會(huì)影響中心代謝途徑分析中的琥珀酸通量。中的琥珀酸通量。己糖激酶（己糖激酶（glk）：此酶為磷酸果糖激酶為）：此酶為磷酸果

25、糖激酶為EMP途徑的關(guān)途徑的關(guān)鍵酶，催化不可逆反應(yīng)。此酶受鍵酶，催化不可逆反應(yīng)。此酶受ATP,O2,檸檬酸的抑制，檸檬酸的抑制，為為AMP所激活。所激活。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)：此酶為產(chǎn)琥珀酸厭氧螺：此酶為產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌和產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中固定菌和產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中固定CO2的主要途徑。的主要途徑。富馬酸還原酶富馬酸還原酶(frd)：由富馬酸生成琥珀酸的關(guān)鍵酶：由富馬酸生成琥珀酸的關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶系：催化由丙酮酸生成乙酰丙酮酸脫氫酶系：催化由丙酮酸生成乙酰CoA的不可逆反的不可逆反應(yīng)。應(yīng)。乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶(adh)：由丙酮酸生成乙醇的關(guān)鍵酶。：由丙酮酸生

26、成乙醇的關(guān)鍵酶。乙酸激酶乙酸激酶(pta)：由丙酮酸生成乙酸的關(guān)鍵酶。：由丙酮酸生成乙酸的關(guān)鍵酶。乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶(ldh)：丙酮酸為受氫體生成乳酸。：丙酮酸為受氫體生成乳酸。PEP羧化激酶產(chǎn)琥珀酸過(guò)程關(guān)鍵酶CO2:濃度水平的調(diào)控。濃度水平的調(diào)控。理論上，每形成理論上，每形成lmol的琥珀酸需要的琥珀酸需要lmolCO2。高濃度高濃度CO2水平將會(huì)增加琥珀酸的產(chǎn)量，乙醇和甲酸相水平將會(huì)增加琥珀酸的產(chǎn)量，乙醇和甲酸相應(yīng)減少。應(yīng)減少。原因原因PEP羧化為草酰乙酸的量增加，羧化為草酰乙酸的量增加， PEP轉(zhuǎn)化為丙酮轉(zhuǎn)化為丙酮酸減少。酸減少。額外電子供體包括氫和電子還原中性紅可使琥珀酸產(chǎn)量額外電子

27、供體包括氫和電子還原中性紅可使琥珀酸產(chǎn)量大大增加，大大增加，與蔗糖相比，使用還原糖如阿拉伯糖、甘露醇、山梨與蔗糖相比，使用還原糖如阿拉伯糖、甘露醇、山梨糖相關(guān)，最終琥珀酸和乙醇量的顯著增加。糖相關(guān)，最終琥珀酸和乙醇量的顯著增加。磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶/ 乙酸激酶 副產(chǎn)物乙酸-磷酸轉(zhuǎn)乙?；? 乙酸激酶( PTA-ACK) 途徑氟乙酸(鈉) 是乙酸類(lèi)似物,可由PTA-ACK途徑被細(xì)菌不可逆地轉(zhuǎn)化為氟代檸檬酸而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。因此,篩選對(duì)氟乙酸具有抗性的突變株,就可能得到PTA-ACK途徑發(fā)生了削弱、乙酸積累降低的細(xì)菌菌株。 策略： 氟乙酸(鈉) 平板培養(yǎng)基篩選 富馬酸鈉唯一碳源平板培養(yǎng)基篩選 高產(chǎn)琥

28、珀酸的菌株, 均產(chǎn)生高活性的富馬酸還原酶。 富馬酸還原酶能夠?qū)⒏获R酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸,而富馬酸在酸性條件下呈渾濁狀,因此可以挑選透明圈較大的菌落以篩選出富馬酸還原酶較高的菌株。江南大學(xué)生物工程學(xué)院鄭璞等江南大學(xué)生物工程學(xué)院鄭璞等，Actinobacillus succinogenes SF-9，以以50 g/ L 的葡萄糖為碳源的葡萄糖為碳源,4 h 后即開(kāi)始加速生長(zhǎng)后即開(kāi)始加速生長(zhǎng),發(fā)酵發(fā)酵36 h 時(shí)產(chǎn)生時(shí)產(chǎn)生40. 51 g/L 琥珀酸琥珀酸,4. 50 g/ L 乙酸乙酸,1. 72 g/ L 甲酸甲酸,0. 47 g/ L 乳酸乳酸, 琥珀琥珀酸轉(zhuǎn)化率酸轉(zhuǎn)化率0. 81 ,琥珀酸琥珀酸/

29、 乙酸為乙酸為9 1 ,副產(chǎn)物乙酸量比出發(fā)菌株降低副產(chǎn)物乙酸量比出發(fā)菌株降低了了50 %左右。左右。Guttler等人（美國(guó)密歇根生物技術(shù)研究所（美國(guó)密歇根生物技術(shù)研究所 ）Actinobacillus succinogenes 具有具有18g.L-1氟乙酸鹽的耐受力，可以產(chǎn)大量氟乙酸鹽的耐受力，可以產(chǎn)大量琥珀酸，同時(shí)具有更高的琥珀酸忍受能力。琥珀酸，同時(shí)具有更高的琥珀酸忍受能力。130Z菌株利用菌株利用98.3g.L-1葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵84小時(shí)可生產(chǎn)小時(shí)可生產(chǎn)66.4g.L-1琥珀酸。琥珀酸。Guettler等人以等人以130Z為出發(fā)菌株，篩選出對(duì)單氟乙酸抗性的自發(fā)突變株。為出發(fā)菌株，篩

30、選出對(duì)單氟乙酸抗性的自發(fā)突變株。此菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的此菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的琥珀酸乙酸比例高到琥珀酸乙酸比例高到85：1；琥珀酸琥珀酸/甲酸比例高達(dá)甲酸比例高達(dá)160：1。在最適條件下，此抗性株的琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到在最適條件下，此抗性株的琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到100g110g/L,發(fā)酵時(shí)發(fā)酵時(shí)間間48小時(shí)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)小時(shí)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)97%但此菌株是迄今為止報(bào)道的唯一耐高糖和高鹽，已經(jīng)具備初步工業(yè)化生但此菌株是迄今為止報(bào)道的唯一耐高糖和高鹽，已經(jīng)具備初步工業(yè)化生產(chǎn)的能力的菌種，產(chǎn)的能力的菌種，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌是目前琥珀酸發(fā)酵最具工業(yè)化潛力的菌株。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌是目前琥珀酸發(fā)酵最具工業(yè)化潛力的菌株。產(chǎn)琥珀酸

31、厭氧螺菌，產(chǎn)琥珀酸放線菌產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌，產(chǎn)琥珀酸放線菌需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，甚至用水都必須經(jīng)過(guò)脫氣處理，這需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，甚至用水都必須經(jīng)過(guò)脫氣處理，這在工業(yè)生產(chǎn)中存在難以實(shí)現(xiàn)性在工業(yè)生產(chǎn)中存在難以實(shí)現(xiàn)性;需要的營(yíng)養(yǎng)條件比較復(fù)雜，往往需要添加比較昂貴的氮源，需要的營(yíng)養(yǎng)條件比較復(fù)雜，往往需要添加比較昂貴的氮源，因此會(huì)造成成本的升高，也會(huì)給后提取工藝增加困難因此會(huì)造成成本的升高，也會(huì)給后提取工藝增加困難;菌種普遍不能耐高滲透的鹽和酸，因此必須采取原位分離菌種普遍不能耐高滲透的鹽和酸，因此必須采取原位分離的技術(shù)，這也為工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)困難。的技術(shù)，這也為工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)困難。因此必須改變菌種的嚴(yán)格厭氧特

32、性和篩選耐粗放發(fā)酵環(huán)境因此必須改變菌種的嚴(yán)格厭氧特性和篩選耐粗放發(fā)酵環(huán)境的菌種，而達(dá)到這樣的目的還需要付出很大的努力。的菌種，而達(dá)到這樣的目的還需要付出很大的努力。（3）大腸桿菌的代謝途徑）大腸桿菌的代謝途徑大腸桿菌在氧氣缺乏的情況下大腸桿菌在氧氣缺乏的情況下可以以硝酸鹽，亞硝酸鹽作為電子的受體進(jìn)行呼吸可以以硝酸鹽，亞硝酸鹽作為電子的受體進(jìn)行呼吸。在缺乏任何氧化劑的情況下在缺乏任何氧化劑的情況下發(fā)酵糖或其衍生物為甲酸，乙酸，乳酸，琥珀酸，乙醇發(fā)酵糖或其衍生物為甲酸，乙酸，乳酸，琥珀酸，乙醇等產(chǎn)物。等產(chǎn)物。各種發(fā)酵產(chǎn)物的比例根據(jù)環(huán)境條件的變化和底物的不同各種發(fā)酵產(chǎn)物的比例根據(jù)環(huán)境條件的變化和底物

33、的不同而變化，不會(huì)過(guò)量合成琥珀酸，因此其琥珀酸的產(chǎn)量而變化，不會(huì)過(guò)量合成琥珀酸，因此其琥珀酸的產(chǎn)量很低，一般在很低，一般在12mol/100mol。己糖激酶（glk）：當(dāng)大腸桿菌采用半乳糖協(xié)同運(yùn)輸體系時(shí)，借助半乳糖透性酶運(yùn)輸糖到體內(nèi)，同時(shí)己糖激酶將其磷酸化。此過(guò)程需要ATP和質(zhì)子梯度。磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶系(pts)：一般認(rèn)為此途徑為更優(yōu)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，因?yàn)椴恍枰|(zhì)子梯度的輔助。異檸檬酸裂解酶(ace): 乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)：大腸內(nèi)主要的固定CO2的酶。丙酮酸羧化酶在大腸桿菌內(nèi)不存在這種酶。 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)：大腸內(nèi)固定CO2的酶。 富馬酸還

34、原酶(frdA,B,C,D)：合成琥珀酸的關(guān)鍵酶。 蘋(píng)果酸酶（mae A,B）:大腸桿菌中存在兩種蘋(píng)果酸酶，一種以NAD為輔基，一種以 NADP為輔基。只有以NAD為輔基的蘋(píng)果酸酶和固定CO2有關(guān)。 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（zwf）：6-磷酸葡萄糖脫氫酶時(shí)HMP途徑中的限速酶，催化不可逆反應(yīng)。其活性受NADP+/NADPH比例的調(diào)節(jié)，NADPH競(jìng)爭(zhēng)性抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶及6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的活性。 野生型大腸桿菌W1485為出發(fā)菌株。 W1485能夠利用大部分糖極其衍生物進(jìn)行厭氧發(fā)酵。 在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，大約6小時(shí)后到達(dá)穩(wěn)定期。發(fā)酵產(chǎn)物為琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇，其中乙醇，

35、乙酸，甲酸的產(chǎn)量最大，琥珀酸為0.2mol/mol葡萄糖。 Clark等人通過(guò)插入外源基因使編碼丙酮酸甲酸裂解酶pfl和乳酸脫氫酶的基因ldh失活構(gòu)建菌株NZN111，NZN111不能以葡萄糖為碳源發(fā)酵生長(zhǎng)，但可以以乳糖，果糖，甘露糖和海藻糖等為碳源發(fā)酵生成琥珀酸，乙酸和乙醇。 這時(shí)底物的氧化還原水平就是決定產(chǎn)物生成比例的關(guān)鍵。耗氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸 細(xì)菌厭氧發(fā)酵琥珀酸的劣勢(shì)： 厭氧型琥珀酸產(chǎn)生菌，其正常生長(zhǎng)的pH通常要求在7.0左右，需要在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中不斷地向反應(yīng)器內(nèi)添加CaO等堿性物質(zhì)，以中和酸性物質(zhì)帶來(lái)的發(fā)酵液pH的下降。 利用細(xì)菌進(jìn)行琥珀酸發(fā)酵，其發(fā)酵液中積累的是琥珀酸鹽而不是琥珀酸，從發(fā)酵液中提取的是琥珀酸鹽晶體，最后將琥珀酸鹽晶體轉(zhuǎn)化成琥珀酸，發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的同時(shí)將產(chǎn)生大量的廢棄物。 細(xì)菌性微生物的生長(zhǎng)和代謝需要以葡萄糖為底物，因此琥珀酸的發(fā)酵生產(chǎn)工藝還需要增加淀粉水解制糖工序 因此將琥珀酸的發(fā)酵、分離提出作為琥珀酸生產(chǎn)工藝的一個(gè)整體來(lái)系統(tǒng)研究，是目前國(guó)外發(fā)酵法琥珀酸生產(chǎn)的主要研究方向。 霉菌好氧發(fā)酵琥珀酸的優(yōu)勢(shì)：霉菌好氧