DNA重組實(shí)驗(yàn)步驟備課講稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA重組實(shí)驗(yàn)步驟-DNA重組實(shí)驗(yàn)步驟要求：1每個(gè)同學(xué)需要的3張照片參見黃色字體。2寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的時(shí)候請(qǐng)將相應(yīng)的試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟寫入，本文僅作參考，不能照抄。試劑盒的說明書在實(shí)驗(yàn)室桌子上都有。第一組：目的基因：GAPDH甘油醛-3-磷酸脫氫酶：片段大小：496bp第二組：目的基因：Actin肌動(dòng)蛋白，片段大?。杭s200bp1.總RNA的抽提（參照植物組織RNA提取試劑盒，本部分直接以提供材料開始，可以不寫）所取材料經(jīng)DEPC水（蠶體或組織）清洗后，添加液氮充分研磨；然后轉(zhuǎn)入1.5mLEppendorf管，

2、加入1mLTRIzol，振蕩2min，室溫靜置5min；4，12000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中；以每毫升TRIzol0.2mL氯仿的比例加入氯仿，振蕩15s左右，室溫放置5min，12000g，4離心15min；取上清液，加0.6mL異戊醇，顛倒混勻，靜置10min；4，12000g離心10min，棄上清；加入1mL用DEPC水配置的75%乙醇洗RNA沉淀，室溫晾干；將沉淀溶于50LDEPC水中，-70保存?zhèn)溆谩?RNA反轉(zhuǎn)錄(參照RT-PCR試劑盒)在Eppendorf管中加入組織總RNA1L，Oligo(dT)181L，40U/LRNaseInhibito

3、r0.5L，5reactionbuffer4L,2.5mmol/LdNTP2L,200U/LRTaseM-MLV1L,然后加DEPC水至20L；42水浴1h，然后70滅活10min，此即為第一鏈cDNA產(chǎn)物。3.PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序及加樣體系(參照RT-PCR試劑盒)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序（上海生工試劑）：94預(yù)變性3min，9450s，55（根據(jù)引物適當(dāng)改變）50s,7250s,30個(gè)循環(huán)。終延伸7210min。反應(yīng)體系總體積25L，反應(yīng)體系中加入：ddH2O16.3L10PCRBuffer（withoutMg2+）2.5L25mmol/LMgCl22.0L2.5mmol/LdNTPmix1.0L

4、Primer-s1.0L（約20pmol/L）Primer-a1.0L（約20pmol/L）cDNA1.0L（約2.0ng）TaqDNA聚合酶0.2L（約1.0U）總體積25.0L1.2%Agarose凝膠電泳，記錄拍照結(jié)果。4.PCR產(chǎn)物的回收與連接DNA回收參照天根AgaroseGelDNAPurificationKit使用說明書。連接：在微型離心管中依次加入純化PCR產(chǎn)物8L（目的基因），pUC192L，buffer4ul，dNPT1ul，T4連接酶1ul，水4ul，共20ul體系。11度20分鐘后70度5分鐘即可。5感受態(tài)細(xì)胞制備挑取大腸桿菌DH5A劃線培養(yǎng)得到的單菌落；挑單菌落接種于

5、3mLLB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后取30L菌液接種于3mLLB液體培養(yǎng)基，37200r/min震蕩培養(yǎng)至OD550達(dá)0.5左右（液體變渾濁即可）；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，冰浴10min；4，3500r/min離心5min，棄上清；用預(yù)冷的75mmol/LCaCl2750L輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴30min；4，3500r/min離心10min，棄上清；加入200L預(yù)冷的75mmol/LCaCl2輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴4h以上，即成感受態(tài)細(xì)胞。6.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液，加入連接產(chǎn)物10L，輕輕混勻，冰浴30min；42水浴1min，立即置于冰浴中2-3min，然后向離心管中加入1m

6、L37預(yù)熱LB培養(yǎng)基，于37200r/min振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；4，3500r/min離心5min，棄900L上清，加入5LX-gal(20mg/mL)和5LIPTG（100mg/mL），輕輕懸浮細(xì)胞，將菌液均勻涂布在含Amp+抗生素的LB固體培養(yǎng)基上；正面放置1h使吸收完全，然后37倒置培養(yǎng)過夜。7重組質(zhì)粒的篩選觀察藍(lán)白斑結(jié)果（拍照記錄，培養(yǎng)皿上有自己的名字，沒有的本次實(shí)驗(yàn)重做），挑取單個(gè)獨(dú)立的白色菌落（可將培養(yǎng)基平板放置4C冰箱顯色），分別接種于3mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基上，37C200r/min震蕩培養(yǎng)過夜。8質(zhì)粒DNA抽提（參照試劑盒）質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒。9酶切反應(yīng)在1.5mL的Eppendorf管中依次加