基因工程--工具酶

1、工具酶載體和1 第四章 工具酶 工具酶基因工程技術(shù)中能用于DNA和RNA 的合成、連接、切割和修飾的各種酶。包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 連接酶, 激酶, 磷酸酶, 2 第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶（Restriction Endonuclease）一. 細(xì)菌的限制一修飾現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)瑞士塞爾生物研究中心Arber提出限制一修飾理論： 核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源DNA, 修飾酶保護(hù)自身DNAArber首次從 E.Coli B菌株中分離出型限制酶EcoB美Hopkings大學(xué) H.Smith 從流感嗜血菌中分離 型 限制酶 Arber, Smith獲得1978 年Nobel獎345二.限制酶系統(tǒng)分類和命名 1

2、985年后大量限制酶被發(fā)現(xiàn)，已從350多種微生物中發(fā)現(xiàn)2000多種限制酶，識別108種不同的特定序列限制性內(nèi)切酶的分類 型: 特異識別、隨機(jī)切割 型：特異識別、同點(diǎn)切割 型：特異識別、異地切割通常所指的限制酶即類酶6 限制酶特性比較 I型 II型 III型限制與修飾由同一酶承擔(dān) 是 否 是酶反應(yīng)輔助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM識別位點(diǎn)特性 / 4-6bp回文對稱/切割位點(diǎn) 距離1kb 識別點(diǎn)中 距3端24-26bp舉例 EcoB BamHI EcoPL識別位點(diǎn)TGAN8TGCT G GATTC AGACC克隆工作中用途 無 有 無SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸7三.系統(tǒng)

3、命名法 限制性內(nèi)切酶的命名方法 屬名 種 變種 序數(shù) 1字母 2字母 1字母 (EcoRI) E co R I (HindIII)H in d III (BamHI) B am H I8 四.一般限制酶的識別特點(diǎn)1. 大多數(shù)是嚴(yán)格的識別順序，少數(shù)可變2. 識別順序的堿基數(shù)一般為4-6 bp，少數(shù)識別更長3. 多數(shù)識別位點(diǎn)具有旋轉(zhuǎn)對稱性，少數(shù)的識別位 點(diǎn)在切割位點(diǎn)之外，具旋轉(zhuǎn)對稱性9 4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX

4、CCANNNNN NTGC N=A, T, G, C10五. 限制酶的切割末端 5粘端（EcoR I） 3粘端（Pst I） 平端 （Sma I）六.限制酶產(chǎn)生的末端的連接 1. 匹配粘端: 直接連接 2. 平末端: 萬能連接 3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端 或Klenow補(bǔ)平11七.識別位點(diǎn)與切割方式之間的關(guān)系 1.識別不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- 2.識別不同，切割產(chǎn)生末端相同(同尾酶) eg: BamHI Bg1 - A GATCT -G GATCC - T

5、CTAG A -CCTAG G123.識別相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGG -GGG CCC- -G GGCC C-4識別相同，切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-13八.限制酶反應(yīng)的影響因素1. 溫度：一般37C，有例外,如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C2. 緩沖液：高、中、低鹽之分 (NaCl)3. 時間：1-1.5小時4. 反應(yīng)體積和甘油濃度：酶8.0) 存在有害試劑(1%乙 醇, DMSO, 乙二醇) 陽離子變化:Mn+, Co+, Zn+

6、, Cu+代替mg+18酶的滅活1.加熱2.酚抽提192021 第二節(jié) 修飾酶一.分類細(xì)菌DNA聚合酶*E. Coli DNA聚合酶（全酶） *Klenow酶T4噬菌體DNA聚合酶 T4噬菌體DNA聚合酶 *測序酶（修飾的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反轉(zhuǎn)錄酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶依賴于DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌體RNA聚合酶 T3噬菌體RNA聚合酶 T4噬菌體RNA聚合酶22連接酶 E. Coli DNA連接 *T4 DNA連接酶 T4噬菌體 RNA連接酶激酶 T4噬菌體多核苷酸激酶磷酸酶*堿性磷酸酶核酸酶 Ba131核酸酶 S1核酸酶 綠豆核酸酶 RNaseA RNase

7、T1 DNaseI EXo 噬菌體外切核酸酶23二.聚合酶1. E. Coli DNA聚合酶 活性:（1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性 主要用途：切口平移法標(biāo)記DNA242. Klenow酶 枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的該酶的大片段 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性 主要用途： (1)補(bǔ)平3凹端 (2)補(bǔ)平3凹端，末端標(biāo)記 (3)合成cDNA第二鏈 (4)體外誘變中從模板合成DNA第二鏈253. T4 噬菌體DNA聚合酶 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow

8、酶強(qiáng)200倍 用途: 3突出端切平 4. T7噬菌體DNA聚合酶 活性： 53聚合酶活性很強(qiáng), 無35外切核酸酶活性 主要用途：修飾后用于測序5. Taq酶 耐熱(75-80 C)的DNA聚合酶專用于PCR266.逆轉(zhuǎn)錄酶： AWV (源于鳥成髓細(xì)胞白血病病毒)， Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒) 活性： (1)53聚合酶活性 (2) RNaseH活性(Mo-MLV 小,cDNA得率高) 主要用途： (1)反轉(zhuǎn)錄cDNA (2) 標(biāo)記5突出端（補(bǔ)平） (3) 測序277.末端轉(zhuǎn)移酶作用:在DNA或RNA3羥基上加dNTP主要用途：(1)載體或cDNA加同聚尾(100nt) (2)DNA的3OH同位素標(biāo)記三. 激酶T4多聚核苷酸激酶催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5 OH主要用途: DNA的5OH同位素標(biāo)記 (寡核苷酸)2829四.連接酶 T4 DNA連接酶 連接：粘端，平端，dsDNA中的切口， 雜交體連接五.堿性磷酸酶 包括細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)和小腸堿性磷酸酶(CIP), 蝦堿性磷酸酶(SAP)用途: 去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸根3031六.核酸酶1.DNA酶 為DNA內(nèi)切核酸酶,水解單鏈或雙鏈 用途:(1)缺口平移標(biāo)記探針時產(chǎn)生隨機(jī)切口 (2)降解DNA2.RNA酶 內(nèi)切核糖核酸酶,專用降解RNA323. S1核