免疫組化的原理與操作

1、Immunohistochemistry免疫組化概述概念:免疫組織化學(xué)(ImmunohistochemistryJHC)是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來檢測組織和細(xì)胞中某種化學(xué)成分的一門技術(shù)，是傳統(tǒng)的免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，也叫原位免疫學(xué)(Insituimmunology)。特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn):(1)特異性強(qiáng)、靈敏度高;(2)可定性、定位、定量觀察;(3)將形態(tài)學(xué)改變與功能和代謝變化結(jié)合起來;IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平）能對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)、客觀觀察的優(yōu)點(diǎn)（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復(fù)染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)反應(yīng)只能定性和定量（離體、液相），而不能定位

2、的缺點(diǎn)。IHC則可在原位和固相對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結(jié)構(gòu)水平。Ill隨著IHC技術(shù)的發(fā)展和圖象分析技術(shù)的發(fā)展,IHC已進(jìn)入多標(biāo)記（雙標(biāo)記）和定量研究的階段，使IHC在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結(jié)合形成的原位雜交技術(shù)（insituhybridization,ISH）既特異性強(qiáng)、靈敏，又具定位、可視的特點(diǎn)。一、IHC的發(fā)展簡史IHC技術(shù)源于免疫熒光術(shù)(immimofhiorescence,IF),從1941年1950年Coons等用了10年首創(chuàng)了熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)一一檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌，六、七十年代IF在科研中

3、占據(jù)著主導(dǎo)地位1968年中根一穗(Nakane)等創(chuàng)建了酶標(biāo)抗體技術(shù)(immunoperoxidase,IPO)鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù)；1974年Stemberger改良上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶一抗體過氧化物酶(PAP)技術(shù)，使免疫細(xì)胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用；80年代Hsu等建立了ABC法之后,免疫金一銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。90年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展；1=2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一；國內(nèi)起步

4、晚，從70s開始。二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景（一）方法學(xué)1從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應(yīng)（免疫反應(yīng)）T親和反應(yīng)。新的親和物質(zhì)對(duì)有：生物素與卵白素（biotin&avidin）,葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG,凝集素與受體，激素與受體。這些親和對(duì)親和力強(qiáng)，且可與多種標(biāo)記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結(jié)合，由此產(chǎn)生了親和組織化學(xué)（affinityhistochemistry）,這些方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2從單一顯示某種物質(zhì)（單標(biāo)記）T顯示多種物質(zhì)（雙標(biāo)記）。3從LM-EM（超微結(jié)構(gòu)）:免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4從定性定量，圖象分析（IA）、流式

5、細(xì)胞術(shù)（FCM）o5.IHC與ISH相結(jié)合，可在不同水平檢測DNA.mRNA、proteino6原位PCR+IHC可在組織原位通過擴(kuò)增檢測微量目的DNA。7趨于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化。（二）技術(shù)分類根據(jù)染色方式分成：貼片染色漂浮染色根據(jù)AgAb結(jié)合方式分成：直接法間接法多層法按標(biāo)記物的性質(zhì)分成：免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)抗體法、橋法、PAD法、ABC法）免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）(三)標(biāo)記物1必要性：組織細(xì)胞內(nèi)Ab結(jié)合反應(yīng)一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標(biāo)記物。常用標(biāo)記物熒光素:最常用的是異硫一氤酸熒光素(Fluoresceinisothioc

6、yanate,FITC)熒光顯微鏡下呈綠色熒光；四乙基羅達(dá)明(rhdamineRB200)熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。生物素:(Biotin)鐵蛋白金等:主要應(yīng)用于免疫電鏡。其他：如同位素(因涉及污染和防護(hù)難一般不用)（四）IHC的應(yīng)用1只要是形態(tài)科學(xué)均可釆用:包括病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物學(xué)、病原微生物的檢測（病毒、細(xì)菌、寄生蟲等）、皮膚病學(xué)、器官移植等。2.可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細(xì)胞（穿刺、體液、涂片、血細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等）。3用于診斷：腫瘤病理學(xué)等（大中醫(yī)院）。FA4用于科研：臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，尤

7、其是形態(tài)學(xué)專業(yè)研究生常用IHC,或IHC+分生技術(shù)；最近幾年，分子生物學(xué)研究異常活躍，但最終還要?dú)w到形態(tài)上來，用免疫組織化學(xué)方法對(duì)所研究的大分子進(jìn)行定位，進(jìn)而深入研究其功能。三、樣品的準(zhǔn)備、處理(一)標(biāo)本的收集與處理IHC染色成功與否及其質(zhì)量如何，除染色方法本身外，對(duì)材料的處理也至關(guān)重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數(shù)量及活性、保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。材料的來源：人體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；細(xì)胞和組織；新鮮的及固定的。1、組織標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存來源：活檢取材、手術(shù)切除、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織等。要求：要快、要小(1X1X0.4cm),避免擠壓。處理：冰凍-即用或保存；固定-即用或保存

8、。2、細(xì)胞標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存來源：血細(xì)胞、穿刺細(xì)胞、體液細(xì)胞等。處理：細(xì)胞多時(shí)直接涂片、干燥、固定、染色；細(xì)胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色;對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞：貼壁生長細(xì)胞（內(nèi)皮C、纖維C、神經(jīng)C等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；懸浮臺(tái)長細(xì)胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。（二）固定（fixation）1、固定的含義固定是指以某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類（變性）、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)保持在組織細(xì)胞原位，避免Ag溶解、擴(kuò)散、丟失；保持組織細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。根據(jù)Ag對(duì)固定劑的耐受性，可將其分為：不穩(wěn)定Ag（如細(xì)胞表面Ag,不耐甲醛，宜用丙酮）、半穩(wěn)定Ag及穩(wěn)定Ag,后二者多為蛋白、肽類、酶類物質(zhì)。

9、固定有時(shí)間性，太短達(dá)不到固定目的，太長交聯(lián)過度，封閉Ag。2、常用固定劑及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）:以pH7.4的PBS配制，優(yōu)點(diǎn)：穿透力強(qiáng)、固定快、組織收縮??；適于固定蛋白、肽類、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時(shí)間46h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對(duì)超微結(jié)構(gòu)保存好。醛類固定劑的缺點(diǎn)是易封閉抗原，必要時(shí)需抗原修復(fù)。3.70%的酒精（乙醇），優(yōu)點(diǎn)：固定蛋白好，缺點(diǎn)：組織收縮嚴(yán)重；時(shí)間：2ho70%丙酮，優(yōu)點(diǎn)：滲透快；缺點(diǎn)：對(duì)形態(tài)保存不好；用于對(duì)冰凍切片和

10、細(xì)胞涂片的固定；時(shí)間：lOmin?；旌瞎潭ㄒ海築onin液：40%PF250mk冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。四氧化娥（OsO4酸）：常用PBS配制1%娥酸溶液后固定lh,用于免疫組化及電鏡觀察。有強(qiáng)烈刺激，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動(dòng)切片不需此步驟。切片可分為：石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片57呻；冰凍切片：浸糖，20%30%蔗糖4吃過夜，減少冰晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，57“m；腦片通常3050ym厚。振動(dòng)切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接用振動(dòng)切

11、片機(jī)做各種厚度的切片，并在染色后可進(jìn)一步制作電鏡標(biāo)本觀察O防脫片劑蛋白甘油，蛋清與甘油1:1攪拌、過濾、防腐；1%的洛磯明膠涂片；0.1%的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。配制時(shí)用塑料瓶而不能用玻璃瓶；購買商品化的進(jìn)口硅化玻片；APES(氨丙基三乙氧基硅烷),1：50丙酮稀釋，浸片2030秒，晾干備用；貼片時(shí)要一步到位。（五）抗原修復(fù)近年興起的新技術(shù)。目的：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。主要適用于經(jīng)長期formalin固定商標(biāo)本、石蠟包埋標(biāo)本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1）微波加熱切片煮沸10-20min,室溫自然冷卻，所用溶液有：飽和NaCL溶液；10mMpH60的枸椽酸鈉緩沖液；4M的尿素等；p

12、H80TBS;（2）高壓鍋處理將切片放入10mMpH6.0的枸椽酸鈉緩沖液容器中，置鍋內(nèi)加蓋噴氣3-10min,自然冷卻。（3）酶消化處理：常用01%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2,pH7.8)37。ClOmin。或0.4%胃蛋白酶37。C30min;（）基本染色方法熒光素標(biāo)記抗體：FITC、直接法TRITC等標(biāo)記抗體法酶標(biāo)記抗體：HRP、AP等”熒光素標(biāo)記抗體間接法酶標(biāo)記抗體（三步法）非標(biāo)記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法；親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法；雙重標(biāo)記：阻斷法（酸洗I抗）、非阻斷法（連續(xù)染）1.直接法熒光素直接標(biāo)記特異性抗體（一抗）上，標(biāo)記抗體與抗

13、原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察-檢測抗原。優(yōu)點(diǎn)：簡單，時(shí)間短,特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟(jì)）。應(yīng)用：基本不用了！2.間接法熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動(dòng)物的igG抗體）。顯色后鏡檢Ab*I+AgAgAbI+Ab-II-熒光素ArAbl-AbI卜熒光素（熒光顯微兢檢測）I三1-1特點(diǎn)：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低;2、不必標(biāo)記每種一抗，只需標(biāo)記某一種動(dòng)物的二抗；3、一抗可高度稀釋，節(jié)省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對(duì)照。3.非標(biāo)記Ab橋法:“橋法”是酶標(biāo)記抗體的改進(jìn)，經(jīng)過三次抗體,其二抗為未標(biāo)記橋抗體。(1)單橋法+Ab-III11兔源抗體I-*Ab

14、-II+底物(2)雙橋法在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次,可增大染色強(qiáng)度。特別提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)系特點(diǎn)：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結(jié)合的酶不易洗去，背景染色重。4.過氧化物酶一抗過氧化物酶法(Peroxidaseantiperoxidasemethod,簡稱PAP法)是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”,先與第一抗體結(jié)合，再與PAP復(fù)合物聯(lián)結(jié)，形成抗原一抗體一抗IgG抗體一PAP復(fù)合物,最后用底物顯色劑顯色。特點(diǎn)：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標(biāo)記抗體法敏感100倍5.親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplext

15、echnique,簡稱ABC法)o關(guān)鍵的程序步驟為3步:Ag+Abl+(Ab2-B)+ABC復(fù)合物(Ab2-B為生物素標(biāo)記的第二抗體)(B為生物素標(biāo)記的過氧化物酶)ABiIrC復(fù)合物是avidin與酶聯(lián)biotin在使用前30min配置，混勻。1個(gè)avidin分子結(jié)合了3個(gè)biotin分子，剩下1個(gè)結(jié)合點(diǎn)與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。(1)ABC復(fù)合物的制備:親合素一生掬素一P0生物素十過氧化物酶CPO)生物素一F0囂(2)ABC法反應(yīng)原理:ODABHzOz特點(diǎn)：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背景也更清晰。Ajidriinny/-nlJt-cvABC法示意圖染色結(jié)

16、果觀察(BrdU)6、酶標(biāo)親和素生物素技術(shù)（labelledavidin-biotintechnique,簡稱LAB法)o即用辣根過氧化物酶直接標(biāo)記avidin,用biotin標(biāo)記2抗。關(guān)鍵步驟為3步:Ag+Abl+（Ab2-B）+A（A為HRP標(biāo)記的卵白素）A與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素(avidin)變換成鏈霉卵白素(streptavidin),LAB法即成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認(rèn)為LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細(xì)胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高?，F(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應(yīng)用。AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素Peroxi

17、daseBiotinAvidin-生物素化II抗I抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）抗原SP法示意圖（-）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）1）、切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復(fù)使用，但次數(shù)不宜多。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時(shí)相反。2）、滅活內(nèi)源性酶：博士德推薦應(yīng)用3%的雙氧水，但實(shí)際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。3）、抗原修復(fù)：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。III4）、正常山羊血清封閉：封閉時(shí)應(yīng)該注意室溫與時(shí)間的相對(duì)III前功盡棄。后面的步驟也是關(guān)系。室溫低，時(shí)間就要長一些，反之亦然。另外，保持反應(yīng)池濕潤是重要的一環(huán)，否則，孵育時(shí)間和溫

18、度與染色強(qiáng)度陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提如此。5）、一抗反應(yīng)：一抗的稀釋度、與背景有直接關(guān)系。一般說來，高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間；背景過高時(shí)則相反。孵育時(shí)間與溫度：抗原抗體充分反應(yīng)是得到可靠結(jié)果的關(guān)鍵。因此，控制溫度與時(shí)間也是一個(gè)嚴(yán)肅的問題。由于室溫控制較為困難，建議4C冰箱過夜Q18h）o6）、二抗（生物素化IgG）反應(yīng)：建議濕盒內(nèi)37Clh,另外儀器顯示溫度37C,但實(shí)際只有23C,自然結(jié)果難以令人滿意。7）、SABC染色（37C）:這是博士德的人性化之處，直接就可以用。8）、DAB顯色鏡下控時(shí)：DAB濃度應(yīng)該比推薦的要低一些，這樣可以便于控制反應(yīng)時(shí)間以及在合適的時(shí)候中止反應(yīng)。同時(shí)注使用后殘余

19、的DAB應(yīng)妥善處理，而不是隨便倒入下水道，因?yàn)樗兄掳┬浴?）、蘇木素輕度復(fù)染：不建議使用。盡管復(fù)染后標(biāo)本層次分明,但實(shí)際情況是，這樣有時(shí)也會(huì)掩蓋陽性結(jié)果，從而使前功盡棄。10）、脫水透明：脫水乙醇的濃度由低到高，有一個(gè)較準(zhǔn)確判斷脫水成功與否的辦法是：觀察透明后盛二甲苯容器的壁，若發(fā)現(xiàn)白色霧狀現(xiàn)象，則說明脫水不成功，應(yīng)再次脫水。透明時(shí)間不要太長，1分鐘左右就可以了。11）、封片：封片時(shí)，中性樹脂量宜少，同時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。（三）免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃根據(jù)課題的內(nèi)容選用動(dòng)物，選用配套的Ab。如AbI鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動(dòng)物，而且AbII必須是羊抗鼠，若PAP法AbIH必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物若要比較染色深淺在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。選用的試劑可靠，貨源充足，隨時(shí)可取。Ab稀釋度(如系購買的藥盒有工作液和原液)工作液：無須稀釋原液：應(yīng)參照其提供的工作液濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)原液的保存(-20C)凍存若工作濃度大于1：500則要先將