抗生素概述、分類和發(fā)酵生產(chǎn)工藝課件

1、抗生素概述、分類和發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.1 概述3.2 青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.3 鏈霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.4 紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.5 四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.1.1 抗生素的定義生物在其生命活動過程中產(chǎn)生（或用化學、生物或生物化學方法衍生的）的在低微濃度下能選擇性的抑制他種生物機能的化學物質(zhì)。天然抗生素，主要利用微生物發(fā)酵，通過生物合成生產(chǎn)的天然代謝產(chǎn)物。半合成抗生素：經(jīng)過化學，生物或生化方法進行了分子改造，制成的這種衍生物，為半合成抗生素。如氨芐青霉素（Ampicillin）。海洋中提取的抗生物質(zhì)如黃連素、海星皂苷等也屬于抗生素范疇。（1）根據(jù)來源生物的屬名定名抗生素，如青霉素。（2）根據(jù)化

2、學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)定名抗生素，如四環(huán)素類抗生素。（3）一些習慣性俗名、發(fā)現(xiàn)的地名等命名，如正定霉素、井岡霉素、金霉素、土霉素等。3.1.2 抗生素的命名原則、抗生素的分類根據(jù)微生物來源分類 ；根據(jù)抗生素的作用機制分類；按醫(yī)療作用對象分類 ；按作用性質(zhì)分類；按抗生素獲得途徑分類；按應(yīng)用范圍分類；根據(jù)生物合成途徑分類；根據(jù)化學結(jié)構(gòu)分類 。細菌結(jié)構(gòu)與抗菌作用部位示意圖-內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)脂類抗生素抗生素的化學結(jié)構(gòu)分類3.1.4 抗生素生產(chǎn)工藝技術(shù)的研究第1條途徑：微生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝。目前大多數(shù)抗生素品種采用發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特點是成本較低，周期較長。第2條途徑：全化學合成生產(chǎn)

3、工藝，結(jié)構(gòu)相對簡單的抗生素可采用此途徑。第3條途徑：半合成生產(chǎn)工藝，利用化學方法修飾改良生物合成的抗生素，擴大抗菌譜、提高療效和降低毒副作用等，獲得新抗生素。微生物合成抗生素包括上游的發(fā)酵和下游提取兩部分，對于劑型產(chǎn)品，還需要經(jīng)過相應(yīng)的制劑工藝。3.2 -內(nèi)酰胺類抗生素青霉素3.2.1 發(fā)展概況 1929年，英國的Fleming青霉素的發(fā)現(xiàn)。1940年，F(xiàn)lorey & Chain, 臨床應(yīng)用青霉素。1945年，意大利的Brotzu發(fā)現(xiàn)一株頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)，并證明它的代謝產(chǎn)物具有廣譜抗細菌作用;1953年，Abraham頭孢菌素C。 1958年，青

4、霉素母核6-氨基青霉烷酸(6-APA);1960年，頭孢菌素C母核7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA) -內(nèi)酰胺類抗生素抗菌機制1、抑制胞壁粘肽合成酶，阻礙粘肽合成，使細胞壁缺損，菌體破裂死亡。-內(nèi)酰胺環(huán)與粘肽五肽的最后二肽（D-丙氨酰-D-丙氨酰）立體構(gòu)型似，可選擇性與轉(zhuǎn)肽酶（肽合成酶，PBPs）結(jié)合阻礙粘肽的交叉聯(lián)結(jié)。對生長中的細胞有效，靜止細胞無效。2、觸發(fā)細菌自溶酶活性。結(jié)構(gòu)特性-lactams青核(penam)頭核(cepham)青霉素頭孢菌素6-氨基青霉烷酸(6-APA)(母核)苯乙酸（側(cè)鏈）D-氨基已二酸(側(cè)鏈)7-氨基頭孢菌酸(7-ACA)(母核)臨床應(yīng)用的主要-內(nèi)酰胺抗生素 天然

5、青霉素：芐青霉素（青霉素G）和青霉素V（苯氧甲基青霉素）。對革蘭陽性細菌有很強的抗菌活性，易受-內(nèi)酰胺酶作用失活而對耐藥菌無效。天然頭孢菌素：頭孢菌素C和7-甲氧頭孢菌素C（頭霉素C）。廣譜抗細菌作用，且對青霉素酶穩(wěn)定；后者還能耐受頭孢菌素酶。青霉素的優(yōu)點是毒性小，但其降解物或聚合物易引起免疫變態(tài)反應(yīng)，即過敏反應(yīng)，臨床應(yīng)用前需要進行皮試。青霉素的缺點是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對革蘭氏陰性菌無效。幾種天然青霉素命名及其活性序號俗名學名側(cè)鏈取代基R-生物活性（U/mg鈉鹽）1青霉素G芐青霉素C6H5-CH2-16672青霉素X對羥基芐青霉素HO-C6H5-CH2-9703青霉素F2-戊烯基青

6、霉素CH3-CH2-CH=CH-CH2-16254青霉素K庚青霉素CH2-(CH2)5-CH2-23005雙氫霉素F戊青霉素CH2-(CH2)3CH2-16106青霉素V苯氧甲基青霉素C6H5-O-CH2-1595青霉素的理化性質(zhì)青霉素是有機酸，易溶于醇、酸、醚、酯類。在水中溶解度很小，且很快失去活性。青霉素G的pK值為，能與無機或有機堿成鹽。青霉素鹽極易溶于水，但難溶于有機溶劑。3.2.2 青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)菌種1928年， Fleming 分離的點青霉（Penicllium notatum）；生產(chǎn)能力很低，遠不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。19381941年H.W.F.弗洛里和E.B.錢恩經(jīng)分離制得

7、青霉素，并發(fā)現(xiàn)它對許多嚴重的全身性細菌感染有良好治療效果，是一個高效低毒抗生素。1943年從美國皮奧利亞一位農(nóng)婦的發(fā)霉甜瓜上分離得到一株產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum NRRL1951）。青霉素生產(chǎn)菌種按孢子形態(tài)分為綠色孢子和黃色孢子的兩種產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrosogenum）菌株。產(chǎn)黃青霉在液體培養(yǎng)基中菌絲可發(fā)育成兩種狀態(tài)，即球狀菌和絲狀菌。目前生產(chǎn)商采用的是綠色絲狀菌株。黃色孢子菌落平坦或褶皺，圓形，邊沿整齊或鋸齒或扇形氣生菌絲形成大小梗，上生分生孢子，排列成鏈狀，似毛筆，成為青霉穗孢子圓形或圓柱形綠色孢子在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，產(chǎn)黃青霉的生長發(fā)

8、育可分為7個階段：第I期分生孢子發(fā)芽，孢子先膨脹，再形成小的芽管，原生質(zhì)未分化，有小空胞；第期菌絲增殖，原生質(zhì)的嗜堿性很強，在期末有類脂肪小顆粒；第期形成脂肪粒，積累貯藏物，沒有空胞，原生質(zhì)嗜堿性仍強；第期脂肪粒減少，形成中小空胞，原生質(zhì)嗜堿性減弱；開始產(chǎn)抗生素；第V期形成大的空胞，其中含有一個或數(shù)個中性紅染色的大顆粒，脂肪粒消失 ；青霉素產(chǎn)量最高；第期細胞內(nèi)看不到顆粒，并出現(xiàn)個別自溶的細胞，釋放氨，pH上升；第期菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。鏡檢控制規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。第14期為菌絲生長期，第3期的菌體適宜為種子。第45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工程措施，

9、延長此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來之前結(jié)束發(fā)酵。3.2.3 青霉素的發(fā)酵工藝流程冷凍管孢子培養(yǎng)25,7天斜面母瓶孢子培養(yǎng)25,7天大米孢子種子培養(yǎng)27,50h1:3vvm一級種子培養(yǎng)液種子培養(yǎng)25,14h1:(11.5)vvm二級種子培養(yǎng)液變溫發(fā)酵26-24200h1:(0.71.8)vvm發(fā)酵液絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程：種子制備種子制備過程可分為兩大階段（如圖）：a b實驗室種子制備階段：瓊脂斜面至固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)（如茄子瓶斜面培養(yǎng)等或液體搖瓶培養(yǎng)）。生產(chǎn)車間種子制備階段：種子罐擴大培養(yǎng)。 生產(chǎn)孢子制備工藝斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米

10、固體培養(yǎng)基上，生產(chǎn)7天，25。注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，CaCO3，玉米油，消泡劑等。空氣流量1:3（體積比），300350 rpm，pH自然， 溫度271, 培養(yǎng)40 h。二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10 %培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，玉米油，消泡劑等1:(11.5)，250280 rpm， pH自然， 251， 培養(yǎng)1014 h。質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，期，倍增期68 h1. 種子罐級數(shù)的確定 種子罐的級數(shù)是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，這要根據(jù)菌種生長的特性、孢子發(fā)芽速度

11、和菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。 接種種齡和接種量接種齡：接種齡一般以菌體處于生長旺盛期，即對數(shù)生長期最合適。 接種量：抗生素的工業(yè)生產(chǎn)，大多數(shù)發(fā)酵的最適接種量為715或更多。 種子質(zhì)量要求：菌絲稠密，菌絲團很少，菌絲粗壯，有中小空胞，處在第期。攪拌器冷卻水進口放料口無菌空氣培養(yǎng)液冷卻水出口排氣口pH檢測及控制裝置電動機加料口發(fā)酵罐示意圖反復(fù)分批式兩段變溫發(fā)酵發(fā)酵罐：100 m3，裝料80 m3，接種量20 %。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，碳酸鈣，玉米油，硅油。參數(shù)條件：1:(0.81.2)；150200 rpm；前60 h，26 ；60 h后，pH6.

12、7, 24 。帶放：6-10次，間隔24 h，帶放量10 %。發(fā)酵周期：180220 h。補料：連續(xù)流加葡萄糖、(NH4)2SO4以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽。關(guān)鍵：補糖率。青霉素的生產(chǎn)周期3.2.4 影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素及發(fā)酵過程控制基質(zhì)濃度的影響前體的影響溫度的影響和控制pH的影響和控制溶氧的在線控制消泡3.2.4.1 基質(zhì)濃度的影響前期基質(zhì)濃度過高，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏(或抑制)或?qū)z生長產(chǎn)生抑制(如葡萄糖和銨的阻遏或抑制，苯乙酸的生長抑制)；后期基質(zhì)濃度低，限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成。碳源的選擇碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。發(fā)酵初期，利用快效的葡萄糖進行菌絲生長

13、。當葡萄糖耗竭后，利用緩效的乳糖，使pH穩(wěn)定，分泌青霉素。碳源占成本12 %以上，采用糖化液流加，降低成本。葡萄糖濃度的調(diào)節(jié)是根據(jù)pH、溶解氧或CO2釋放率予以調(diào)節(jié)。什么是6-APA6-氨基青霉烷酸 6-APA由青霉素鉀鹽酶化裂解而成，是生產(chǎn)半合抗青霉素類抗生素氨芐鈉和阿莫西林的重要中間體。發(fā)酵過程中也產(chǎn)生6-APA，但產(chǎn)量很低。糖與6-APA結(jié)合形成糖基-6-APA，影響青霉素產(chǎn)量。 在青霉素的生產(chǎn)中，讓培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40 h生長，而在40 h后，靠低速連續(xù)流加葡萄糖和氮源等，使菌體處于半饑餓狀態(tài)，延長青霉素的合成期，大大提高了產(chǎn)量。殘?zhí)?.30.6 %左右，pH開始

14、升高時流加糖濃度：500 kg/m3；流速：1.01.25 kg/(m3h)發(fā)酵動力學菌體干重殘?zhí)橇骷拥纯刂朴衩诐{：最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。但其質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)量較少，故可用花生餅粉或棉籽餅粉取代。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素（有機氮）。氨基氮濃度：控制在0.010.05%間。鹽離子控制硫和磷：硫濃度降低時青霉素產(chǎn)量減少3倍；磷濃度降低時青霉素產(chǎn)量減少1倍。鈣、鎂和鉀：合適的陽離子比例為鉀30%、鈣20%、鎂41%。如鎂離子少，鉀離子多時，菌絲細胞將培養(yǎng)基中氮源轉(zhuǎn)化成各種氨基酸的能力強。鈣離子影響細胞的生長和培養(yǎng)基的pH。鐵易滲入菌絲內(nèi)，對青霉素合成有毒，3040g/m

15、l以下，故罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。3.2.4.2 前體的影響及控制 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G的側(cè)鏈前體。利用途徑：青霉菌可將前體直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中，也可作為養(yǎng)料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過哪個途徑被菌利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。 前體的毒性：前體對青霉菌的生長發(fā)育有毒性，其毒性大小取決于培養(yǎng)基的pH值和前體的濃度。苯乙酰胺在堿性時毒性較大，pH=8時即抑制菌體生長；苯乙酸在酸性(pH=5.5)時毒性較大，堿性時不抑制菌絲體生長；pH值在中性時苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體濃度一般始終維持在為宜。前體的氧化培養(yǎng)基的成分，p

16、H，菌齡苯乙酸被菌體氧化的速率，隨培養(yǎng)基的pH值上升而增加。 苯乙酸被菌體氧化的速率，隨著菌齡的增大而增加。間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的辦法，保持前體的供應(yīng)速率僅略大于生物合成的需要。 3.2.4.3 提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯?？扇苄愿叻肿踊衔铮壕垡蚁┐?、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇。其他：剪切保護劑；分散劑。3.2.4.4 溫度的影響及控制 一般生長的適宜溫度為30，而分泌青霉素的適宜溫度是在20，但周期很長。變溫控制法，生長階段較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。如采用從26逐漸降

17、溫至24的發(fā)酵溫度。3.2.4.5 pH值的影響及控制 最適pH值，一般認為是，應(yīng)盡量避免超過在青霉素發(fā)酵過程中pH值是通過下列手段控制的：pH值過高，可加糖、硫酸或無機氮源；pH值較低可加入CaCO3、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。也有利用自動加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH值維持在最適范圍，以提高青霉素產(chǎn)量補糖方式控制 pH ：一種是恒速補糖，用酸或堿來控制pH值；另一種是根據(jù)pH值來補糖，即pH值上升得快就多補，pH值下降時少補，以維持范圍。 3.2.4.6 溶氧的在線控制溶氧30飽和度以下時，青霉素產(chǎn)量急劇下降；溶氧10飽和度以下時，則造成不可逆轉(zhuǎn)的損失。溶氧濃度過高，菌絲生長不良

18、或加糖率過低通氣比：1:（）。適宜的攪拌速度：保證氣液混合，提高溶氧。調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速：各階段的生長和耗氧量不同。葡萄糖流加控制的參考指標之一。3.2.4.7 泡沫控制天然油脂：玉米油；化學消泡劑：泡敵；策略：少量多次；注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。3.2.5 青霉素的分離純化工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活；水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定；易溶于有機溶劑，水中溶解度很??；青霉素鹽很穩(wěn)定，降解產(chǎn)物具有致敏性；防止降解，條件需溫和、快速。青霉素的生物合成與理論產(chǎn)量一氨基己二酸的生物合成 ：葡萄糖+NH3+0.5ADP+0.5Pi+6NAD+ 一氨基己二酸+3C02+0.5Pi+6N

19、ADH (I)前體氨基酸的生物合成 (3)半胱氨酸的生物合成 ：葡萄糖+NH3+SO42-+12.5ATP+4NADH+FAD 半胱氨酸+AMP+PAP+10.5ADP+9.5Pi+2PPi+4NAD+FADH2 (III)(2)纈氨酸的生物合成 ： 葡萄糖+NH3+0.5ATP 纈氨酸+C02+0.5ADP+0.5Pi (11) 青霉素的合成半胱氨酸+纈氨酸+ -氨基己二酸+苯乙酸+ADP+Pi+3ATP+NAD+FAD青霉素G+6-氧氫化吡啶-2-羥酸+4AMP+4PPi+NADH+FADH2 (V)將式(I)、()、()、(V)相加，得青霉素G生物合成的總化學式：3葡萄糖+3NH3+SO

20、42-+苯乙酸+1.5ATP+3NAD+2FAD 青霉素G+6-氧氫化吡啶-2-羥酸+4CO2+PAP+5AMP+6PPi+9.5ADP+8.5Pi+3NADH+2FADH2 青霉素的理論生產(chǎn)得率： 葡萄糖+3NH3+SO42-十苯乙酸2青霉素G+6-氧氫化吡啶-2-羥酸2 相對的基質(zhì)符號 表示單位 備注 molmol ggUmg 葡萄糖 氨 氧 苯乙酸 Yps Ypn Ypo Ypp 0.31 0.39 0.33 0.42 0.26 1.0 0.6l 0.77 6.99 8.87 2.94 2.62 1022 1284 11649 14789 4893 4364 ,以青霉素G鈉鹽表示。-氨基

21、己二酸不循環(huán)使用。64的-氨基己二酸循環(huán)使用。表 青霉素的理論生產(chǎn)得率提煉工藝過程步驟：發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾青霉素的提取青霉素的精制及烘干3.2.5.1 發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理 目的：分離菌體，除去雜質(zhì)雜質(zhì)：高價無機離子（Ca2+,Mg2+,Fe3+）和蛋白質(zhì)Ca2+草酸，草酸鈉Mg2+三聚磷酸鈉Fe3+黃血鹽（亞鐵氰化鉀）蛋白質(zhì)等電點，加明礬或絮凝劑法發(fā)酵液和濾液10一次過濾鼓式真空過濾機一次濾液：，略發(fā)渾，棕黃色或棕綠色。蛋白質(zhì)含量一般在2.0 mg/ml（個別情況下可達到7.0 mg/ml）二次過濾：澄清透明，用于提取（收率90%）板框過濾機0.07%硅藻土，作為助濾劑硫酸酸化去除蛋白質(zhì)：

22、硫酸調(diào)加入0.07%溴代十五烷吡啶（PPB，去乳化劑，破壞W/O型乳濁液）圖1 濾框和濾板1-濾框 2-濾板 3-濾板外框架 4-濾板柵 5-支撐格篩 6-壓蓋框圖2 板框壓濾機外形 1-固定端板2-濾板 3-濾框 4-活動端板 5-活絡(luò)接頭 6-支承 7-傳動齒輪 9-手輪 圖5 板框式壓濾機操作示意圖(a) 過濾階段 (b)洗滌階段實際上，隨著高效高速萃取離心機的出現(xiàn)，如德國Westfalia公司出品的傾析器（decantor），可省去過濾工序，比用板框過濾除去菌絲后再提取的收率高出23%。3.2.5.2 青霉素的提取和精制 溶劑萃取法原理： 青霉素與堿金屬所生成的鹽類在水中溶解度很大，而

23、青霉素游離酸易溶解于有機溶劑中。 萃?。╡xtraction）是利用液體或超臨界流體為溶劑提取原料中目標產(chǎn)物的分離純化操作，所以，萃取操作中至少有一相為流體，一般稱該流體為萃取劑（extractant)。 萃取分離的特點：1、 比化學沉淀法分離程度高；2、 比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；3、 比蒸餾法能耗低， 生產(chǎn)能力大，周期短，連續(xù)操作，可以自動化控制；4、 和其他新型分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了一系列新型分離技術(shù)。有機溶劑的選擇 相似相溶的原理有機溶劑還應(yīng)滿足以下要求：(1)價廉易得；(2)與水相不互溶；(3)與水相有較大的密度 差，并且粘度小，表面張力適中，相分散和相分離較容易；(4)容易回收

24、和再利用；(5)毒性低，腐蝕性小，閃點低，使用安全；(6)不與目標產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。 表 青霉素的分配系數(shù)溶 劑pH=2.5(溶劑水)pH=7.0(溶劑水)溶 劑pH=2.5(溶劑水)pH=7.0(溶劑水)醋酸戊酯45/11/235氯 仿39/11/220醋酸丁酯47/11/186三氯乙烯21/11/260醋酸乙酯39/11/260乙 醚12/11/190逆流萃取過程正向萃?。核峄?，濾液:醋酸丁酯，碟片式離心機分離（濃縮倍）反相萃?。海姿猁}、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取23次，達到結(jié)晶要求。萃取條件：10。萃取罐冷凍鹽水冷卻。溫度的影響 一般來說，溫度升高則引起互溶的程度增加，當升高至某一溫度時，甚至可使兩相區(qū)消失，這樣萃取操作成為不可能。一方面，降低系統(tǒng)的溫度可提高萃取效率與料液的分離程度。 另一方面，降低操作溫度會使液體粘度增大，擴散系數(shù)減少，并增加整個系統(tǒng)的冷卻負荷和動力消耗。 整個萃取過程應(yīng)在低溫下進行（在10以下），在保證萃取效率的前提下，盡量縮短操作時間，減少青霉素的