細(xì)菌真菌放線菌培養(yǎng)基配方

1、細(xì)菌培養(yǎng)基：肉膏蛋白月東培養(yǎng)基是一種廣泛 用于培養(yǎng)細(xì)菌的一.培養(yǎng)基，肉膏蛋白月東培養(yǎng)基的主要成分是牛 肉膏、蛋白月東和NaCl。肉膏蛋白月東培養(yǎng)基.藥品比例：牛肉膏3g,蛋白月東10g, Nacl5g ,瓊脂 15 20g ,水 1000mL ,PH7.4 7.6.實(shí)驗(yàn)器材：牛肉膏、蛋白月東、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、lmol/LHCl、KNO、NaCl、K HPO - 3HO、MgSO 7HO、222434FeSO 7HO、4.5mL 無菌水 6 管，10%酚 液，49.5mL無菌水(帶玻璃珠)124 瓶。土壤樣品、試管、培養(yǎng)皿、移液管、三 角瓶、燒

2、杯、量筒、玻璃棒、天平、稱量紙、 牛角匙、pH試紙、棉花、報(bào)紙、記號(hào)筆、 線繩、紗布、酒清燈。電爐、高壓蒸氣滅菌 鍋、超凈工作臺(tái).配置方法(1)稱藥品：按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方 稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯。 蛋白月東極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。(2)加熱溶解：在燒杯中加入少于所需要 的水量，然后放在石 棉網(wǎng)上，小火加熱， 并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水 分至.所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊 脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防 瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。(3)調(diào)pH:檢測(cè)培養(yǎng)基的 pH,若pH 偏酸

3、，可滴加lmol/L NaOH ,邊加邊攪拌， 并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需 pH 范圍。若偏堿，則用lmol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。 pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基 內(nèi)各離子的濃度。(4)過濾：液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固 體培養(yǎng)基可用4層紗 布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。（5）分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng) 基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用漏斗 以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5 ,滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過 其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管X4

4、|X4身度 的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。制）加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普 通棉花（非脫脂棉（6作的棉塞。棉塞的 形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁, 不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利 通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。 有些微生物需要更好的通有時(shí)也氣，則可用8層紗布制成通氣塞 可用試管帽或塑料塞代替棉 塞。(7)包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包 一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)以 5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮 紙，用繩扎好。然后用記號(hào)筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。(8)滅菌：將上述培養(yǎng)基于 12

5、1.3 C濕 熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌， 則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。(9)擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁 熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不 超過試管總長的。1/2(10)無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入 37 C 溫箱中培養(yǎng)2448h ,無菌生長即可使用， 或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。二,放線菌培養(yǎng)基：高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO 作為氮源，3KHP0、 MgSO 和 FeS0作為無機(jī)鹽等4244高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基1.藥品比例：可溶性淀粉20g0 . 5gNaCI1gKNO 3K HPO 5

6、g0 3H O4 22.7HO . 5g0MgSO 2 4.01gFeSO . 7 H0O4225g瓊脂15水 1000ml7.6 7.4 pH.實(shí)驗(yàn)器材：試管，錐形瓶，燒杯，量筒， 玻璃棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，高壓蒸汽滅 菌器，PH試紙，棉花，牛皮紙，麻繩，紗 布.配制方法：（1）、稱量和溶化 按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中， 并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中, 繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再 稱取其他各成分，并依次溶化，對(duì)微量成分 FeSO .7 H O 可先配成高濃度的貯備24液，按比例換算后再加入。待所有試劑完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積 配制固

7、體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入已溶 的試劑中，在加熱融化，最后補(bǔ)充所損失的水分。、調(diào)pH用試紙測(cè)培養(yǎng)基的原始 PH,如果偏酸，用滴 管向培養(yǎng)基中加入1mol/LNaOH,邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用pH試 紙測(cè)其pH,直至pH達(dá)7.6。反之,用1mol/LHCI進(jìn)行調(diào)節(jié)(3)、分裝和加塞 將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)， 在試管口或錐形瓶口上塞上棉塞。(4)、包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，其外再用一根麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(5)、滅菌0將上述培養(yǎng)基以 C,20min,0.103MPa 高壓蒸汽滅菌。121(6)、擱置斜面o左右，將試管口端擱在玻璃棒 C

8、將滅菌的 試管培養(yǎng)基冷卻至 50。上。斜面的斜度要 適當(dāng)，使斜面的長度約為管長1/3(7)、無菌檢查0,以檢查滅菌是否28hC的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24將滅菌培養(yǎng)基放入 37徹底。三.真菌培養(yǎng)基：馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(馬 丁氏培養(yǎng)基)馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基1.藥品比例KHPOIg ,MgSO 7HO 0.5g ，蛋白月東 5g, 葡萄糖10g ,瓊脂1520g, 2424水1000mL ,自然pH 此培養(yǎng)液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3. 3ml。臨用時(shí)每 100ml培養(yǎng)基中加 1%鏈霉素液0. 3ml。（孟加拉紅和鏈霉素主 要是細(xì)菌和放線菌的抑制劑，對(duì)真菌無抑制作用, 因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以得到優(yōu)

9、勢(shì)生 長，從而達(dá)到分離真菌的目的）.實(shí)驗(yàn)器材KH2PO4 , MgSO4?7H2O ,蛋白月東，葡萄糖, 瓊脂，孟加拉紅，鏈霉素；試管，三角燒瓶，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝 器，扭力天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋.配制方法(1)稱量和溶解：先計(jì)算后稱量，按用量 稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中C 待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成 1%的水溶液，在 1000mL培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液 3.3mL,混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法 同牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基配制。(2)分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉 膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。(3)鏈霉素的加入：鏈霉素受熱容易分解, 所以臨用時(shí)

10、，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45 C左右時(shí)才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于-20 C）,在100mL培養(yǎng)基中加 1%鏈霉素0.3mL，使每毫升培養(yǎng)基中合鏈霉素 301go四.滅菌采用高壓蒸氣滅菌法進(jìn)行滅菌，步驟如下：.首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入 適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切勿忘記加水，同時(shí)水量不可過少，以防滅 菌鍋燒干而引起炸裂事故。.放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意 不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。 三角燒瓶與試 管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋 的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱

11、的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。.用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥， 使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需 壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1Mpa ,121.5 C, 20min 滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。.滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“ 0”時(shí)，才能打開排氣閥， 開蓋取物。否則

12、就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā) 生污染，甚至灼傷操作者。.將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37 C溫箱培養(yǎng)24h,經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可 待用。五.土壤微生物的分離.取土壤：取表層以下 510cm處的土樣， 放入無菌的袋中備用，或放在4c冰箱中暫存。.制備稀釋液（要無菌操作）（1）制備土壤懸液：稱土樣 0.5g ,迅速倒 入帶玻璃珠的 49.5mL無菌水瓶中（玻璃 珠用量以充滿瓶底力最好），振蕩510min ,使土樣充分-2的土壤懸液。10打散，即成為-2的土壤懸液 0.5mL ,放入.5mL無稀釋：用

13、無菌移液管吸（2）10-3-3-8稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成 菌水中 即為10的稀釋液。1010注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀 釋度換用一支移液管，每 次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。六.混菌法測(cè)定菌落數(shù)的方法-7-6兩管稀釋液各1mL、10,分別接入相 應(yīng)標(biāo)號(hào)的平（1）細(xì)菌：取10皿中，每個(gè)稀 釋度接兩個(gè)平皿。然后取冷卻至 50 c的牛 肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中（裝量以鋪滿皿底高 1.52mm為宜），迅速輕輕搖動(dòng)平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混 勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板。倒平板時(shí)要注意 無菌操作。

14、-5-4兩管稀釋液，在每管中加入 10%酚液5 (2)放線菌：取 10、 10 6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中 吸出1mL加入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，用與細(xì)菌相 同的方法倒入平皿中，便 可制成放線菌平板。-2-3,分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的兩管稀釋各1mL3)真菌：取 10、10 (平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。在融化的馬鈴薯培養(yǎng)基中，每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕輕搖勻，然后用與 細(xì)菌相同的方法倒入平皿 中，便可制成真菌的平板。4.培養(yǎng)：將接種好的細(xì)菌、放線菌、真菌 平板倒置，即皿蓋朝下放置，于2830 c中恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng) 12d,放線菌培養(yǎng) 57d, 真菌培養(yǎng)35d

15、。觀察生長的菌落，用于進(jìn) 一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。七.（一）平板制作及劃線分離方法。.倒平板：按無菌操作要求，在火焰旁操 作。.劃線分離： 使用接種環(huán)， 從待純化的 菌落或待分離的斜面菌種 只沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線 分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落。.培養(yǎng)：方法同“土壤稀釋分離”。(二)斜面接種和穿刺接種.斜面接種(1)取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標(biāo) 記(寫上菌名、接種日期、接種人等)，然 后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新 鮮培養(yǎng)基斜面上。(2)接種的方法是， 用接種環(huán)沾取少量待 接菌種， 然后在新鮮斜面上“之”字形劃線，方向是從下部開始，一直劃至上部(圖3-

16、4A)。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。(3)接種后30 C恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)48h, 放線菌、霉菌培養(yǎng)至胞子成熟方可取出保存。.穿刺接種(1)取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白月東柱狀 培養(yǎng)基，做好標(biāo)記(寫上菌名)、接種日期，接種人等)。(2)接種的方法是， 用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部(但不要穿透)，然 后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。(3)接種后30c恒溫培養(yǎng)，24h后觀察,比較兩種菌的生長結(jié)果。八、注意事項(xiàng).稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品 應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。.調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。.不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體 操作。. 一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及真菌 次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中， 故從土壤中分離細(xì)菌 時(shí)，要取較高的稀釋度， 否則菌落連成一片不能計(jì)