基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)分子寄生蟲學(xué)第二講

1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)分子寄生蟲學(xué)第二講傳病媒介的分子生物學(xué)傳病媒介主要是指那些可以傳播疾病的無脊椎動物，其中絕大多數(shù)是節(jié)肢動物，如蜱、螨、蚊、蠅和白蛉等分子鑒別：傳播媒介的正確鑒別是該領(lǐng)域最基礎(chǔ)的研究內(nèi)容，傳統(tǒng)的鑒別方法在遇到形態(tài)相似的近緣種時常會遇到混淆和出現(xiàn)錯誤，運用分子特征鑒別即可解決上述難題提供幫助。常用的分子特征是核糖體DNADNA的一些片段，如ITS，IGS（基因間隔區(qū)）28S編碼區(qū)的第三結(jié)構(gòu)域，線粒體DNA12（CO1,CO2），細胞色素b（cytb）等。在分類鑒別研究的漫長歷程中，在不同時期和階段研究者運用不同的方法或依據(jù)不同類型的特征對同一類群命名了許多“型”，如形態(tài)型、生態(tài)型、染色體型

2、、同工酶型以及分子型等，這些型是分類研究中的過渡階段，進一步明確其分類地位并使其相互統(tǒng)一，建立標(biāo)準(zhǔn)的鑒別方法是今后研究的重點內(nèi)容之一。傳病媒介的分子生物學(xué)轉(zhuǎn)基因WHO于20世紀90年代提出基因操作（gene manipulation）控制蚊蟲的新策略，即通過轉(zhuǎn)基因手段，把蚊蟲抵抗瘧原蟲感染的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入蚊基因組，使其穩(wěn)定遺傳并在自然種群中驅(qū)動擴散，從而減少甚至阻斷蚊蟲的傳瘧效能02年10月岡比亞按蚊基因組發(fā)布目前蚊蟲免疫和防御的分子機制研究主要集中在岡比亞按蚊和埃及伊蚊，發(fā)現(xiàn)多個基因在受到瘧原蟲攻擊后，mRNA轉(zhuǎn)錄量發(fā)生改變，如抗菌肽防御素、革蘭氏陰性菌結(jié)合相關(guān)蛋白、幾丁結(jié)合相關(guān)蛋白、絲氨酸蛋

3、白酶相關(guān)蛋白、半乳糖凝集素相關(guān)蛋白和氮氧化物合成酶等傳病媒介的分子生物學(xué)轉(zhuǎn)基因難以估計參與蚊蟲免疫應(yīng)答的基因數(shù)量，但預(yù)計十分龐大2002年另一突破性進展是轉(zhuǎn)基因斯氏按蚊在實驗室培育成功，研究人員將一種與蚊中腸上皮有很強親和力的抗瘧肽基因與羧基肽酶激活物和信號肽相連接轉(zhuǎn)入蚊蟲。轉(zhuǎn)基因蚊在吸食感染性血后，瘧原蟲卵囊的數(shù)量與普通蚊相比約80被抑制，并觀察到瘧原蟲沒有從轉(zhuǎn)基因蚊傳播到小鼠中。傳病媒介的分子生物學(xué)群體群體遺傳結(jié)構(gòu)研究是探討種內(nèi)不同群體遺傳表型多樣性及群體動力學(xué)的基礎(chǔ)，其結(jié)果可為蟲媒病的流行規(guī)律提供預(yù)測預(yù)報信息，并為轉(zhuǎn)基因蟲媒在自然群體中的驅(qū)動擴散提供重要的基礎(chǔ)同工酶指標(biāo)常低估群體中變異的

4、量RFLP、RAPD、微衛(wèi)星DNA以及序列標(biāo)志等RAPD-PCR和RFLP技術(shù)對埃及伊蚊和白紋伊蚊種內(nèi)群體的判別方法進行探討。中華按蚊群體顯示具有較高的遺傳多態(tài)性遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部，各地中華按蚊群體的遺傳結(jié)構(gòu)基本相同，沒有明顯分化。傳病媒介的分子生物學(xué)群體微衛(wèi)星或單一序列重復(fù)單元是迄今調(diào)查從昆蟲至哺乳動物各種生物群體結(jié)構(gòu)及其動力學(xué)最好的分子指標(biāo)岡比亞按蚊的群體遺傳結(jié)構(gòu)與同域分布的近緣種阿拉伯按蚊自然群體間基因流水平較低，不同生態(tài)型群體和染色體型群體間具有廣泛的基因流基因流水平的高低與染色體倒位頻率相關(guān)聯(lián)，也與微衛(wèi)星位點的選擇有關(guān)。群體與個體的差異比原先估計的要大的多，提示蚊蟲群體遺傳結(jié)

5、構(gòu)在多方面的復(fù)雜性，如習(xí)性、抗性及易感性等，增加媒介控制策略的難度系統(tǒng)發(fā)育，抗性基因是研究熱點抗藥性的擴散規(guī)律與群體遺傳結(jié)構(gòu)也有密切關(guān)系分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)基因克隆技術(shù)：又稱之基因工程，是20世紀70年代末在多種交叉學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)其 上建立起來的重要分子生物學(xué)技術(shù)。其含義為在體外將核酸分子插入到病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之進入到原來不含這類分子的宿主細胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地存在，從而實現(xiàn)特定的功能表達：目的基因的獲得與純化；重組DNA分子的克隆與擴增；表達載體的構(gòu)建與目的基因的表達目的基因的獲得：PCR技術(shù)擴增，從基因組獲得的基因，原核生物可直接用于基因工程表達，而真核生物

6、基因則需要重新拼接去除內(nèi)含子后才可用于基因工程表達；基因人工合成，基因的人工化學(xué)合成具有快速、有效、靈活的優(yōu)點，尤其對于設(shè)置某種生物偏愛密碼子以利于在該生物中高效表達、插入或消除基因內(nèi)部特定限制性內(nèi)切酶位點，獲得天然基因的衍生物等方面具有無可比擬的優(yōu)勢；基因組文庫或cDNA文庫篩選：基因文庫是將某生物的基因組DNA通過工具酶切割成不同的片段，分別克隆入載體，得到的克隆群體即構(gòu)成基因文庫。利用合適的探針雜交，可從中篩選含有靶基因的克隆；cDNA文庫是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄形成互補cDNA，再與載體連接、包裝后形成。從中可篩選得到真核生物含polyA尾的mDNA基因，不含polyA尾的真核mRN

7、A與原核生物mRNA,則不能從cDNA文庫中得到核酸技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)重組載體的克隆和轉(zhuǎn)化：獲得的線狀DNA片段不具備自主復(fù)制功能，需要把基因片段連接到具備自主復(fù)制功能的DNA載體上，重組后引入宿主細胞中才能復(fù)制、擴增、繁殖。構(gòu)建和選擇適合于克隆的載體是基因工程技術(shù)的關(guān)鍵。選擇載體時，需要考慮載體可容納外源片段的大小，所含多克隆位點，篩選標(biāo)志以及拷貝數(shù)等。重組載體通過熱沖擊、電轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)染等方法介導(dǎo)入合適的受體細胞，在其中繁殖擴增，擴增得到的目的基因可通過需要克隆到表達載體上表達或進一步分析使用PCR：20世紀80年代發(fā)展起來的體外酶促擴增特定DNA片段的技術(shù)。它具有特異、敏感、快速

8、、簡單等優(yōu)點。DNA文庫與cDNA文庫：制備基因組文庫的典型方法是對高分子質(zhì)量基因組DNA進行部分酶切，這些酶切產(chǎn)物的組成取決于基因組DNA中限制性內(nèi)切酶酶切位點的分布以及這些位點被切割的相對速率核酸技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)DNA文庫與cDNA文庫：構(gòu)建基因組文庫時需要選用高容量的載體，這不僅可大大減少構(gòu)建和篩選的工作量，而且有利于物理圖譜和遺傳圖譜的繪制；構(gòu)建一個cDNA文庫最基本的步驟是從mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈DNA拷貝的過程。mRNA的質(zhì)量是影響cDNA質(zhì)量的重要因素DNA序列分析技術(shù)：工作基礎(chǔ)是在變性聚丙酰胺凝膠上進行高分離度的電泳過程。DNA測序主要用于鑒定新構(gòu)建的克隆，檢驗新產(chǎn)生

9、的突變，檢查連接產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性;雙脫氧測序法；化學(xué)修飾法；Southern雜交；RNA的分離和純化：為分析基因表達，闡明基因的調(diào)控特性，必須了解基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、水平、大小和穩(wěn)定性等特性，而分離得到高純度的RNA是進行分析工作的前提核酸技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)DNA序列分析技術(shù)：反義核酸技術(shù)，該項技術(shù)是繼基因重組技術(shù)后分子生物學(xué)領(lǐng)域興起的一種全新的技術(shù)。該技術(shù)由Izant和Weintraub于1984年提出，其含義為：用人工合成或生物合成的特定互補的DNA或RNA序列，導(dǎo)入靶細胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA雜交鏈，從而抑制或封閉特定基因的表達，使其喪失活

10、性，達到基因控制和治療的目的反義核酸技術(shù)可分為3類：反義寡核苷酸技術(shù)；反義RNA技術(shù)核酶技術(shù)，反義核酸技術(shù)的作用機制尚未完全清楚。核酸技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)RNA干涉是在演化中保留下來的一個過程，通過該過程，雙鏈RNA誘導(dǎo)目標(biāo)基因的沉寂，它已迅速成為阻斷基因活性的標(biāo)準(zhǔn)實驗技術(shù)。“小干涉RNA”（siRNA）由約20 個堿基對組成，有5個磷酸鹽、2個核苷和3個懸臂，在RNA沉寂通道中扮演中心角色，是瞄準(zhǔn)特定信使RNA進行降解的指導(dǎo)要素。1990年， Napoli和其同事在研究轉(zhuǎn)查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因chs的矮牽牛植株中，發(fā)現(xiàn)chs基因和內(nèi)源基因同時被抑

11、制了，稱為“共抑制”基因沉默（gene silencing）：指生物體中特定基因由于種種原因不能表達。作為一種基因表達調(diào)控機制，基因沉默通常只在外來核酸入侵時發(fā)揮作用。這里特定基因主要針對外源基因，也包括與外源基因同源的內(nèi)源基因。RNAi： RNA 干涉（RNA interference），1998 Andrew Fire和Craig Mello提出，指通過轉(zhuǎn)入外源RNA而使細胞內(nèi)特定的同源基因沉默的現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默RNA干涉技術(shù)RNAi是一個依賴ATP的過程，在此過程中，dsRNA(外源或內(nèi)生)首先被降解為具3端有23nt突出、長2123bp 的小分子雙鏈RNA，這種RNA稱為小

12、干擾RNA（siRNA）。siRNA通過堿基互補配對識別具同源序列的mRNA，并介導(dǎo)其降解。在RNAi過程中一種稱為Dicer的核酸酶負責(zé)將dsRNA酶切轉(zhuǎn)化為siRNA，siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(RISC)，此復(fù)合物通過堿基互補配對識別靶mRNA 并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)RNA干涉技術(shù)RNAi技術(shù)被2002年12月science評為十大科技進步之首麻省理工大學(xué)的生物學(xué)家、諾貝爾獎獲得者菲利普夏普認為，RNAi技術(shù)將成為十年來甚至幾十年來最重要和激動人心的科學(xué)突破分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)RNA干涉技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技

13、術(shù)大腸桿菌表達系統(tǒng)：是以大腸桿菌為宿主菌，載體上帶有大腸桿菌可識別的啟動子、終止子和其它表達元件。是表達許多異源蛋白質(zhì)首選方法哺乳動物表達系統(tǒng)：哺乳動物表達系統(tǒng)具有完整的翻譯后加工功能，而且能分泌表達功能性蛋白質(zhì)。其宿主細胞包括猴腎細胞、小鼠L細胞及Hela細胞等，采用的載體可分為質(zhì)粒載體與病毒載體。缺點是哺乳動物細胞不易培養(yǎng)，成本高，且表達產(chǎn)量不高酵母表達系統(tǒng)：釀酒酵母表達系統(tǒng)：能進行翻譯后的部分加工，基因組小，繁殖快，易培養(yǎng)，成本低，具較好的分泌功能等。其表達載體主要為質(zhì)粒，根據(jù)表達產(chǎn)物分泌與否，可以分為表達型和分泌型兩種類型；畢赤酵母表達系統(tǒng)：三高特點，高密度生長、高水平表達、高水平分泌

14、。缺陷是蛋白水解活性較高，表達產(chǎn)物易被降解?；虮磉_蛋白質(zhì)技術(shù)分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)親和層析：建立在蛋白質(zhì)和結(jié)合在介質(zhì)上的配基間特異親和力基礎(chǔ)上的一種純化方法。這種相互結(jié)合不僅是專一性的，且在特定條件可進行解離而不喪失待純化蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，如酶和底物、抗體和相應(yīng)抗原等。如用鎳柱純化離子交換：也是蛋白質(zhì)常用純化方法之一，與其它方法相比，易操作，處理量大，選擇性好，價格低廉，可以大規(guī)模應(yīng)用。其原理為利用不同蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)的差異及在離子交換樹脂上的不同結(jié)合特性，達到選擇性分離產(chǎn)物的目的。分子篩（molecular sieve filtration）分子篩又稱為凝膠過濾層析（gel filtr

15、ation）,是依據(jù)各個組分蛋白質(zhì)間不同的分子量而加以分離的?；虮磉_蛋白質(zhì)技術(shù)-重組蛋白的分離純化分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)SDS（聚丙烯酰胺凝膠電泳） SDS是對蛋白質(zhì)進行量化、比較及鑒定的一種快速、經(jīng)濟的方法，主要用于蛋白質(zhì)純度的分析、分子量的測定等雙向電泳 雙向凝膠電泳是兩種高分離度電泳過程的結(jié)合，第一為等電聚焦（載體兩性電解質(zhì)pH梯度），第二為梯度SDS電泳。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。雙向電泳的結(jié)果不是條帶，而是許多相互分離的圓形或橢圓形斑點?；虮磉_蛋白質(zhì)技術(shù)-蛋白質(zhì)電泳分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸的排列順序決定了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和功能，

16、因此一級結(jié)構(gòu)的測定是進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中不可缺少的內(nèi)容，亦可作為蛋白質(zhì)的一種鑒定方法。進行序列分析的蛋白質(zhì)樣品，一般要求純度在95以上，通常用色譜或電泳制備，蛋白質(zhì)的N末端測序主要采用Edmen化學(xué)降解法基因表達蛋白質(zhì)技術(shù)-蛋白質(zhì)序列分析分子寄生蟲學(xué)的常用技術(shù)蛋白質(zhì)晶體學(xué)是建立在X射線衍射實驗技術(shù)基礎(chǔ)的揭示分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的科學(xué)包括晶體培養(yǎng)、數(shù)據(jù)收集和處理、相位測定、電子密度圖的計算和解釋、結(jié)構(gòu)模型修正基因表達蛋白質(zhì)技術(shù)-蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析寄生蟲的生物多樣性在生物演化過程中，每一種生物類群占用一定的空間，擁有一定的數(shù)量。在一定空間內(nèi)，巨大數(shù)量的個體反映了從個體變異、生理株、地理型（株）

17、、變種、亞種到種的變化這一客觀實際。寄生蟲是一類種群數(shù)量很大、變異極為復(fù)雜的低等動物關(guān)于動物多樣性及其產(chǎn)生原因的問題長期困惑著生態(tài)學(xué)家許多寄生蟲是從自由生活過渡到寄生生活，使得研究者去研究他們的進化過程，這與物種形成速率和多樣性產(chǎn)生相關(guān)證據(jù)表明，在寄生蟲種系（lineage）多樣性產(chǎn)生中，同域的物種形成（）可能是普遍的寄生蟲可能對于研究生態(tài)學(xué)特殊性、物種形成機制以及多樣性的產(chǎn)生可能是理想模型寄生蟲的生物多樣性寄生蟲存在著生物多樣性（biodiversity）。包括種類多樣性、生殖發(fā)育多樣性、生態(tài)分布多樣性以及遺傳多樣性寄生蟲種類多樣性：寄生蟲種群數(shù)量難以估計，宿主誘導(dǎo)寄生蟲的表型變化（vari

18、ability in phenotype）,就有可能導(dǎo)致不正確地將一個種分為兩個種或更多個同源種（），而造成寄生蟲種類的夸張估計相反，不同種類歸于一種，分子分型揭示命名的新種，即使如此，隱蔽種，雖然形態(tài)相似，同域，但完全是獨立的繁殖個體。寄生蟲生活史的復(fù)雜性可能會影響寄生蟲物種形成和多樣性，但缺少證據(jù) 大學(xué)課件出品 版權(quán)歸原作者所有 聯(lián)系 ：910670854 如侵權(quán)，請告知，吾即刪 更多精品文檔請訪問我的個人主頁 附贈人生心語人生太短，聰明太晚人生太短，聰明太晚(1)我們都老得太快卻聰明得太遲把錢省下來，等待退休后再去享受結(jié)果退休后，因為年紀大，身體差，行動不方便，哪里也去不成。錢存下來等養(yǎng)

19、老，結(jié)果孩子長大了，要出國留學(xué)，要創(chuàng)業(yè)做生意，要花錢娶老婆，自己的退休金都被拗走了。人生太短，聰明太晚(2)當(dāng)自己有足夠的能力善待自己時，就立刻去做，老年人有時候是無法做中年人或是青少年人可以做的事，年紀和健康就是一大因素。小孩子從小就告訴他，養(yǎng)你到高中，大學(xué)以后就要自立更生，要留學(xué)，創(chuàng)業(yè)，娶老婆，自己想辦法，自己要留多一點錢，不要為了小孩子而活我們都老得太快卻聰明得太遲，我的學(xué)長去年喪妻。這突如其來的事故，實在叫人難以接受，但是死亡的到來不總是如此。學(xué)長說他太太最希望他能送鮮花給他，但是他覺得太浪費，總推說等到下次再買，結(jié)果卻是在她死后，用鮮花布置她的靈堂。這不是太蠢愚了嗎？！等到、等到，似

20、乎我們所有的生命，都用在等待。人生太短，聰明太晚(3)等到我大學(xué)畢業(yè)以后，我就會如何如何我們對自己說等到我買房子以后！等我最小的孩子結(jié)婚之后！等我把這筆生意談成之后！等到我死了以后人人都很愿意犧牲當(dāng)下，去換取未知的等待；犧牲今生今世的辛苦錢，去購買后世的安逸在臺灣只要往有山的道路上走一走，就隨處都可看到農(nóng)舍變精舍，山坡地變靈塔，無非也是為了等到死后，能圖個保障，不必再受苦。許多人認為必須等到某時或某事完成之后再采取行動。明天我就開始運動，明天我就會對他好一點，下星期我們就找時間出去走走；退休后，我們就要好好享受一下。人生太短，聰明太晚(4)然而，生活總是一直變動，環(huán)境總是不可預(yù)知，現(xiàn)實生活中，

21、各種突發(fā)狀況總是層出不窮。身為一個醫(yī)生，我所見過的死人，比一般人要來得多。這些人早上醒來時，原本預(yù)期過的是另一個平凡無奇的日子，沒想到一個意料之外的事；交通意外、腦溢血、心臟病發(fā)作等等。剎那間生命的巨輪傾覆離軌，突然闖進一片黑暗之中。那么我們要如何面對生命呢？我們毋需等到生活完美無瑕，也毋需等到一切都平穩(wěn)，想做什么，現(xiàn)在就可以開始做起。一個人永遠也無法預(yù)料未來，所以不要延緩想過的生活，不要吝于表達心中的話，因為生命只在一瞬間。人生太短，聰明太晚(5)記住！給活人送一朵鮮花，強過給死人送貴重的花圈，每個人的生命都有盡頭，許多人經(jīng)常在生命即將結(jié)束時，才發(fā)現(xiàn)自己還有很多事沒有做，有許多話來不及說，這

22、實在是人生最大的遺憾。別讓自己徒留為時已晚的空余恨。逝者不可追，來者猶未卜，最珍貴、最需要實時掌握的當(dāng)下，往往在這兩者蹉跎間，轉(zhuǎn)眼錯失。人生太短，聰明太晚(6)人生短暫飄忽，包得有一首小詩這樣寫：高天與原地，悠悠人生路；行行向何方，轉(zhuǎn)眼即長暮。正是道盡了人生如寄，轉(zhuǎn)眼即逝的惶恐。有許多事，在你還不懂得珍惜之前已成舊事；有許多人，在你還來不及用心之前已成舊人。遺憾的事一再發(fā)生，但過后再追悔早知道如何如何是沒有用的，那時候已經(jīng)過去，你追念的人也已走過了你。人生太短，聰明太晚(7)一句瑞典格言說：我們老得太快，卻聰明得太遲。 不管你是否察覺，生命都一直在前進。人生并未售來回票，失去的便永遠不再得到。

23、將希望寄予等到方便的時間才享受人生太短，聰明太晚(8)我們不知失去了多少可能的幸福不要再等待有一天你可以松口氣，或是麻煩都過去了。生命中大部分的美好事物都是短暫易逝的，享受它們、品嘗它們，善待你周圍的每一個人，別把時間浪費在等待所有難題的完滿結(jié)局上。找回迷失的生命死亡也許是免費的 但是，卻要付出生命的代價。勸大家一句話：把握當(dāng)下，莫等待。成功人生的十堂課人生成功第1課 做一個終生學(xué)習(xí)的人，離開學(xué)校并不意味著學(xué)習(xí)就結(jié)束了。學(xué)習(xí)可以成為一種生活方式，幫助你發(fā)揮最大的潛能。我們從未停止學(xué)習(xí)，總會有新的，有趣的東西等待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。學(xué)習(xí)新的技能可能讓人感到有一點恐懼，但每當(dāng)我們在個人學(xué)習(xí)上停滯不前時，我

24、們都需要去學(xué)習(xí)新的東西。積極地尋求支援和建議，突破停滯期。參加一些培訓(xùn)，進修，夜校任何新的興趣都將會有助于發(fā)展你的優(yōu)勢。多看，多聽，讓你的頭腦保持活躍?；畹嚼?，學(xué)到老。 人生成功第2課 令自己感到沮喪的秘訣就是用空閑時間去煩惱自己是否快樂。所以不要費事去想它！摩拳擦掌干起來吧。你將熱血沸騰，你會頭腦清醒。很快，在你身體中的這種高漲的積極人生觀將把煩惱從你的頭腦中趕出去。行動起來，忙碌起來。這是世界上最便宜的一種藥，也是最好的一種。人生成功第3課 在困境中尋找成功的希望逆境是一所最好的學(xué)校。每一次失敗，每一次打擊，每一次損失，都蘊育著成功的萌芽，都教會我在下一次有更出色的表現(xiàn)。我再也不會逃避現(xiàn)實

25、，也不會拒絕從以往的錯誤中獲取經(jīng)驗，我不再因此而促成自己的失敗。因為我知道，寶玉不經(jīng)磨礪就不能發(fā)光，沒有，我也不能完善自我?，F(xiàn)在我知道，靈魂倍受煎熬的時刻，也正是生命中最多選擇與機會的時刻。任何事情的成敗取決于我在尋求幫助時是抬起頭還是低下頭。無論何時，當(dāng)我被可怕的失敗擊倒，在最初的陣痛過去之后，我都要想方設(shè)法將苦難變成好事。偉大的機遇就在這一刻閃現(xiàn)這苦澀的根必將迎來滿園芬芳！ 我將一直在困境中尋找成功的希望。 人生成功第4課 沒有人可以使你感到自卑我選擇自我感覺良好，這樣我能更加開放地學(xué)習(xí)。如果人們給我負面的回應(yīng)或是批評我做的事情，我不會認為他們所說的就表明我是一個“差勁的”人。我堅信自尊由

26、我掌控，這讓我毫無戒心地去聽取別人的反饋，想看看是否有我可以學(xué)習(xí)的東西。我們每天都有兩種選擇。我們可以感到自己很棒，也可以感到自己很差勁。難道有人會選擇后者嗎？人生成功第5課緊緊抓住夢想我們每個人都有夢想。我們每個人都希望能發(fā)自內(nèi)心地相信自已有一種特殊的天賦，相信自己能發(fā)揮重要的作用，相信自己能以一種特殊的方式感動他人，相信自己能夠把世界變得更加美好。在一生中，我們都曾經(jīng)對自己渴望并追求的生活品質(zhì)抱有憧憬。然而，對我們大多數(shù)人來說，這些憧憬在日常生活的成規(guī)和挫敗中已經(jīng)變得如此渺茫，以到于我們甚至不再努力去實現(xiàn)它們。對太多人來說，夢想已經(jīng)遠離，隨之遠離的還有塑造我們命運的意愿。很多人已經(jīng)推動了堅

27、定的信念，而正是堅定的信念為勝利者創(chuàng)造了優(yōu)勢。我們所要做的就是重拴夢想，并實現(xiàn)夢想，讓我們每個人都記住，并去運用深藏在自己身上的無限潛能。人生成功第6課 毅力無法替代世界上沒有任何東西可以替代毅力。才干不可以，無所作為的能人十分普遍；天分不可以，碌碌無為的天才盡人皆知;教育不可以，受過良好教育的沒落者更是隨處可見。只要有毅力和決心，就是無所不能的。毅力并不總是意味著永遠堅持做同一件事。它意味著無論你做任何事情，你都要立刻全心投入，竭盡全力；它意味著先做艱苦的工作，再去期待隨之而來的滿足和回報。它意味著開心地工作，渴望更多的知識和進步。它意味著多打幾個 ，多夏裝幾里路，多除草，早起床，意味著總是

28、尋求更好的方式去做你在做的事情。毅力就是經(jīng)歷考驗和過失的成功。 人生成功第7課駐足片刻聞花香在現(xiàn)代生活的忙忙碌碌中，人們很少會停下來欣賞自然的美。問問自己，你有多少次傾聽過鳥兒的歌唱。你最近一次抬頭仰望閃耀的星空又是在什么時候？時光飛逝，人生苦短。不要忘記駐足聞聞花香。我們在急于謀生的過程中，往往忽視了我們生活的品質(zhì)。多少次，你聽見人們?yōu)檫@為那說“我忙死了?！倍嗫上О?！有一天，當(dāng)他們真的找到時間能夠駐足片刻聞花香時，可能已經(jīng)太遲了。 人生成功第8課加入到微笑者和贊美者的行列來當(dāng)你對別人，別人也會對你報以，你自然會感覺很棒。即使他有對你報以，你也會感覺很棒，因為你認識到世界上最貧窮的人就是從不微

29、笑的人，當(dāng)你對那個人微笑，你立刻變得更加富有。贊美也是這個道理。當(dāng)你真誠地毛病抑或恭維一個人時，他將立刻受益，更喜歡自己。當(dāng)你讓別人感覺更好時，你自己也會感覺更好。人生成功第9課 讓自己快樂。調(diào)查表明，我們當(dāng)中70%的人在生活中時間有臨床性的抑郁現(xiàn)象。如今我們有這么多的機遇，為什么我們還這么不快樂呢？人們嘗試各種東西：金錢，權(quán)利，事業(yè)，婚姻，離婚，酒精，搖滾甚至毒品，但我們大多數(shù)人只是想要得到一樣?xùn)|西快樂。快樂是人的一種自然的身心狀態(tài)；我們只要去相信快樂，讓自己感受快樂。要宣稱：我應(yīng)當(dāng)?shù)玫娇鞓贰?說出來，唱出來，喊出來。優(yōu)先考慮快樂，讓快樂成為你最重要的事情。對你所擁有的一切抱以感激之情吧。

30、人生成功第10課 我擁有無與倫比的想象力現(xiàn)在我將通過這種神奇的力量得到我想要的。 如果我害怕發(fā)表演講，我就想象自己在公眾場合無所畏懼，充滿信心；如果我在病魔的煎熬，我就想象我以前健康的樣子；如果我感到貧窮，我就想象我將要富有。 現(xiàn)在我明白了：人類惟一的限制就是想象力。我之所以沒有成功，原因就在于我不知道如何使用我的想象力?，F(xiàn)在，我精通這個技巧，我將從中受益。最大的回報將是成功和愈加快樂。你會管理時間嗎?如何讓自己一天的時間不止24小時呢?這里有一些總結(jié):你會管理時間嗎?（1）1.對目標(biāo)、任務(wù)、會議等事件分別按優(yōu)先級進行排序；2.從優(yōu)先級最高的事物著手；3.和拖延做斗爭，如果事情重要，從現(xiàn)在開始

31、做；4.把大的、艱難的任務(wù)細分為小的、容易的部分；5.為自己創(chuàng)造一小時的寧靜，哪怕這需要很強的意志力，或者有時不起作用；你會管理時間嗎?（2）6.找到一個隱蔽的地方，如圖書館或空閑的辦公室；7.當(dāng)你有重要的事情要處理時，學(xué)會對別人說“不”；8.學(xué)會委派別人做事；9.歸納相似的事情，把它們放在一起處理；10.減少例行事務(wù)：它們不值得花費過多時間?？s短低價值的事件。拋開沒有價值的信件和文書工作。委派別人完成、減少或推遲優(yōu)先級很低的任務(wù)；你會管理時間嗎?（3）11.避免完美主義。記住80/20定律；12.避免做出過多許諾。對你在有限時間內(nèi)能完成的工作持現(xiàn)實態(tài)度；13.不要把時間表排得滿滿的，為自己留

32、下一定機動時間應(yīng)付突發(fā)事件；14.設(shè)置時間限制。例如，做某些決定時，不應(yīng)超過3分鐘；15.聚精會神地做手頭的事情；你會管理時間嗎?（4）16.處理重要事情時，使用大塊的時間；17.迅速處理困難的事情，等待和拖延不會使它們變?nèi)菀祝?8.文書工作爭取只處理一次；19.在行動以前，徹底地思索整件工作；20.第一次就做好。成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（1） 1：找方法，不找借口。2：遇到挫折時，對自己說“太棒了”。3：不說消極的話，不落入消極的情緒，一旦出現(xiàn)立即正面處理。4：隨時用零碎時間做零碎的事。5：寫下來，不要太依靠腦袋記憶。6：隨時記錄靈感。7：守時8：把重

33、要的觀念方法寫下來，并隨時提醒自己。9：走路時，比平時快30%，肢體語言要健康，有力，不懶惰，不萎靡。10：每天自我反省一次。11：每天堅持一次運動。12：開會坐在前排。13：微笑。14：說話時，聲音有力。15：說話之前，先考慮對方的感受16：每天有意識或真誠地贊美別人3次17:不要用訓(xùn)斥 指責(zé)的口吻跟別人說話.18:每天做一件分外事.19:節(jié)儉.20:恪守誠信,說到做到.成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（2）“好的習(xí)慣讓人立于不敗之地，壞的習(xí)慣則讓人從成功的寶座上跌下來”。拿破侖希爾認為，保羅蓋蒂的這句話很有道理。有一段時期，蓋蒂抽煙抽得很兇。一天，他去法國度假的途中，在一個小旅館投宿。晚上

34、下起了大雨，地面特別泥濘，開了好幾個鐘頭的車之后，蓋蒂實在是累極了。吃過晚飯，他就回到自己的房間里，睡著了。但是清晨時分蓋蒂突然醒了過來，他很想抽支煙，于是他就打開了燈，很自然的伸手去摸他一般都會放在床頭的煙，但是沒有。他下了床，到衣服的口袋里去找，也沒有。于是他又在行李袋里找，結(jié)果他又一次失望了。他知道這個時候旅館的酒吧和餐廳早就關(guān)門了。他想，這個時候把不耐煩的門房叫過來，實在是不可能?，F(xiàn)在他唯一能得到香煙的方法就是穿好衣服，到火車站去，但是那還在6條街之外呢。 成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（3）看來情形并不樂觀，外面還下著雨。他的汽車也停在離旅館還有一段距離的車房里。而且，在他住店的時

35、候，別人也提醒過他了。車房的門是午夜關(guān)，第二天早上6點才開門，現(xiàn)在能叫到出租車的機率也相當(dāng)于零。顯然，要是他真的迫切地需要一支煙，那么他只能在雨里走到黑暗中。抽煙的欲望不斷地折磨著他。于是，他下了床，脫下睡衣，穿好衣服，準(zhǔn)備出去。正在他伸手拿雨衣的時候，他突然笑了起來，笑自己傻。他突然覺得，自己的行為多荒唐可笑。蓋蒂站在那里，心里不停地想著，一個所謂的知識分子，一個商人，一個認為自己有足夠的智慧可以對別人下命令的人，居然在三更半夜要離開舒適的旅館，冒著大雨走上好幾條街去買香煙。蓋蒂也是生平第一次注意到，他現(xiàn)在早就養(yǎng)成了一個壞習(xí)慣，那就是為了一個不好的習(xí)慣，他可以放棄極大的舒適?？磥?，這個習(xí)慣對

36、他并沒有什么好處，于是，他的頭腦立刻就清醒了過來，很快他就做出了決定。成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（4）他已經(jīng)決定好了，就走到桌子旁邊把那個煙盒團起來扔出去，然后重新?lián)Q上睡衣，回到舒服的床上。心里懷著一種解脫，甚至是一種勝利的感覺，很滿足地關(guān)上燈，合上了眼睛。在窗外的雨聲里，他進入了一個從來沒有過的深沉的睡眠。自從那個晚上之后，他再也沒抽過一根煙，也再沒有想過要抽煙。蓋蒂說，他并不是想用這件事來指責(zé)那些有抽煙習(xí)慣的人。但是他經(jīng)?；貞浤翘焱砩系那樾危皇菫榱吮硎?，按照他當(dāng)時的情況，他差點被一種惡習(xí)俘虜。經(jīng)常做一件事就會形成習(xí)慣，而習(xí)慣的力量是難以抗拒的。但是人類還有一種潛藏的緩沖能力，也不

37、容小覷。既然人有可能養(yǎng)成一種習(xí)慣，那肯定他也有能力改掉這種習(xí)慣。還有些人說，奇怪的是，養(yǎng)成好習(xí)慣很難，但是一個壞習(xí)慣卻在不知不覺中就已經(jīng)形成了。但是，事實并非如此，這還要看一個人的毅力。不管怎么說，習(xí)慣終歸是習(xí)慣，并沒有合理的理論說壞習(xí)慣要比好習(xí)慣更容易養(yǎng)成。成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（5）動作敏捷或遲緩只是個時間的問題，一個人要么習(xí)慣了準(zhǔn)時，要么他就會習(xí)慣遲到。一個準(zhǔn)時的人，總會體會到這種習(xí)慣給他帶來的好處，無論是約會，會議，還是什么別的方面的承諾。如果別人請你吃飯，你遲到了，那就會給主人和其他的客人造成不便。你可能會因此而變得很不受歡迎，以后人家都不會再請你吃飯了。拿破侖 希爾認為，

38、對商人來說，準(zhǔn)時是一項特別寶貴的資產(chǎn)。俗話說得好，“時間就是金錢”，這句話永遠是正確的，現(xiàn)在這個時代里，這個原則比以前更加重要?，F(xiàn)代企業(yè)的步調(diào)是一日千里，分秒必爭。主管和高級職員的每日安排都是滿滿的，因為他們可沒有多余的時間可以浪費，就像生產(chǎn)線不能耽擱一樣。守信對生意人來說，是個難得的品德，最有希望成功的商人和公司，他們一定是準(zhǔn)時接受定單，準(zhǔn)時回復(fù)并交貨，提供服務(wù)，準(zhǔn)時付款，準(zhǔn)時還債。如果等時間已過去了，訂貨還沒到，那顧客下次可能就不找你了。成功是一種習(xí)慣，習(xí)慣是需要培養(yǎng)的（6）節(jié)儉是另外一種可以養(yǎng)成的習(xí)慣，對天生節(jié)儉的人來說，這個習(xí)慣給他帶來的成功的機會要比別人多。而習(xí)慣了節(jié)儉的人，他只知道

39、在乎時就要注意節(jié)減開支和成本。 受用一生的教誨：職場10只魔戒 N條箴言第只魔戒 第一條箴言：習(xí)慣仿佛像一根纜繩，我們每天給它纏上一股新索，要不了多久，它就會變得 牢不可破。第二條箴言：人類所有優(yōu)點都要變成習(xí)慣才有價值，即使愛這樣一個永恒的主題，你也 必須通過不斷的修煉，變成你的習(xí)慣，才真正會化為你的行動。第三條箴言：很多好的觀念、原則，我們知道是一回事，但知道了是否能做到是另 一碼事。這中間必須架起一座橋，這橋便是習(xí)慣。第四條箴言：科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，一個習(xí)慣的養(yǎng)成需要天的時間，這天是個平均數(shù)， 但習(xí)慣一旦養(yǎng)成就將終生受用。第五條箴言：任何一個習(xí)慣的培養(yǎng)都不會是輕而易舉的，因此一定要遵循循序漸進

40、、由淺入 深、由近及遠、由漸變到突變的原則。第只魔戒 第一條箴言： 人生來是簡單的，和文明打交道之后變得復(fù)雜了，陷入了某種復(fù)雜的旋渦中 無法自拔，這些羈絆使人忘記人性的最終追求是平靜、簡單、自由。第二條箴言：不經(jīng)過復(fù)雜的簡單是一種蒼白，我曾經(jīng)很人為地把金錢放在一邊它卻不安分， 但今天當(dāng)我駕馭了金錢，它就能很安分地呆在一邊。第三條箴言：要鍛煉一個人的財商，讓他具有富人心態(tài)，首先他確實要學(xué)會放棄，同時也要 學(xué)會克服，要學(xué)會走出很多障礙和陰影。第四條箴言：財商教育的根本目的是讓人們獲得自由，增加收入、減少財務(wù)問題的初衷是減 少人們在金錢上的虛榮心和攀比風(fēng)。第五條箴言：財商教育要解決人類面對金錢的兩大

41、問題：恐懼與貪婪。而為了生活穩(wěn)定這個 假象，人們常常淪為金錢的奴隸。第六條箴言：對于金錢，不是說你要成為它的主人，而是要做到與之和諧、平等，因為它反 映的是你自己，所以對它要多一分寬容。第只魔戒 第一條箴言：成功的實質(zhì)就是獲得自由度，就是當(dāng)你想當(dāng)?shù)娜耍瞿阆胱龅氖?，去你想去?地方，說你想說的話。 第二條箴言：世上沒有懶惰的人，只有沒有目標(biāo)的人。世界上最貧窮的人就是沒有目標(biāo)的人 ，因為連夢想都沒有，還會擁有什么？第三條箴言：只有明確而具體的目標(biāo)才可衡量，而只有可衡量的目標(biāo)才可能達到。第四條箴言：付出就表示富有，索取就是貧窮，快行動起來，用行動表現(xiàn)你的富有。第五條箴言：心態(tài)、目標(biāo)、時間管理三者的

42、集中點就是在行動上，三者的表現(xiàn)特征也是行 動。它們共同形成知行合一的統(tǒng)一體。 第只魔戒 第一條箴言：人的一生就是不斷地闖入一個又一個圈子并不斷爭取承認的過程。第二條箴言：在西方社會，特別是在北美，只有那些樹立自我推銷和成功意識的人，才有可 能贏得機會與成功。第三條箴言：國際化人才不是一個地理意義上的概念，而是文化、心理層面的概念。是否是 國際化人才取決于一個人的涵養(yǎng)、知識構(gòu)成和思維模式。第四條箴言：創(chuàng)業(yè)的失敗率是非常高的，在美國，每年有幾十萬人開公司，每年也有幾十萬 家公司倒閉，所以創(chuàng)業(yè)只適合一部分人。第五條箴言：我時常摸著跳動的心口，數(shù)著那一下一下的脈搏，計算著我的生命長河究竟能 卷起多少浪

43、花。我要讓短暫的生命，爆發(fā)出火花。第六條箴言：命運不是機遇，而是一種選擇。命運從來都不是一種可以等到的東西，而是一 件需要去完成的事情。第只魔戒 第一條箴言：不管你對成功如何定義，積極總是有價值的。積極不一定成功，但消極肯定失敗。第二條箴言：成功學(xué)的最大的特征就是強調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化和量化，把認為說不清楚、不可琢磨的東 西都變成可琢磨、可操作的東西。第三條箴言：成功絕對有捷徑，當(dāng)然它的捷徑絕對不是整個過程，這個捷徑告訴我們的是必 須按照最有效的成功策略去做，否則你就會越忙越出錯。第四條箴言：人的改變會遵循一定的軌跡，即：結(jié)果決定于行為，行為決定于態(tài)度，態(tài)度決 定于信念，信念決定于自我期望。第五條箴言：人

44、對環(huán)境有四種反應(yīng)：第一是離開環(huán)境；第二是改變環(huán)境；第三是適應(yīng)環(huán)境； 第四是抱怨環(huán)境。前三種反應(yīng)都有可能從中找到新的生機，只是千萬不要選擇第四種反應(yīng)。第六條箴言：成功的秘訣第一個是堅持到底，永不放棄；第二個就是當(dāng)你想放棄的時候，再 照著第一個秘訣去做：堅持到底，永不放棄。第只魔戒第一條箴言：人們總是感到自己是對的，別人和世界都是不對的；所以人們總想改變世界、 改變別人，很少想到改變自己。其實，改變世界應(yīng)該先從改變自己開始。第二條箴言：不少老板都恨不得把員工改造成跟自己一樣的人，其實最不像你的人、你最不 喜歡的人，或許正是你的團隊最需要的人。第三條箴言：性格本身并沒有好壞之分，也沒有誰對誰錯。樂觀

45、和悲觀對這個世界都有貢獻 ，前者發(fā)明了飛機，后者發(fā)明了降落傘。第四條箴言：這是一個充斥著個性的時代，這是一個崢嶸著個性的社會，許多個性相差甚遠 的人都在適于自己的路上找到了自己最好的歸宿。第五條箴言：個性是半個生命，喪失個性就是半個死亡。第只魔戒 第一條箴言：中國人的問題是更重視歷史，但缺少前瞻性的思維。其實我們更應(yīng)該具有未來 決定現(xiàn)在這樣一種思考。第二條箴言：如果中國只變成一個世界工廠是不行的，我們的最大優(yōu)勢是人，但現(xiàn)在還只是 重視數(shù)量而沒重視質(zhì)量。第三條箴言：社會認可是動態(tài)的，歷史上有很多人就是生前不被社會認可的，像梵高的畫， 像馬克思的思想。第四條箴言：個性化發(fā)展強調(diào)的是你自己的個性，是

46、適合自己的途徑，我切身的體會不是學(xué) 識上的成長，而是精神上的成長。第五條箴言：科技發(fā)展的日新月異、信息的爆炸，使本領(lǐng)的地位比任何時代都高，本領(lǐng)恐慌 比任何時代都更可怕。第六條箴言：在世紀，擁有創(chuàng)造性學(xué)習(xí)能力是最根本的應(yīng)變之道。 第只魔戒 第一條箴言：在生活中所極力追求的，應(yīng)該是按自己內(nèi)心深處確認的人類的永恒價值，而不 是流行的市場價值。第二條箴言：人的智慧力、道德力和意志力，是重要的“人格三要素”。這三種力量越強的 人，越容易達到自我實現(xiàn)的最高境界。第三條箴言：高峰體驗既是一種最佳狀態(tài)，又是一種終極體驗。經(jīng)歷了這種高峰體驗的人， 也就會產(chǎn)生這輩子沒有白活的感覺。第四條箴言：物質(zhì)需要屬于匱乏性需

47、要，它的滿足引起的感覺是短暫的、膚淺的；自我實現(xiàn) 需要是成長性需要，它的滿足才會產(chǎn)生持久的、深刻的感覺。第五條箴言：第一流的菜湯比第二流的繪畫更具有創(chuàng)造性。第只魔戒 第一條箴言：任何職業(yè)生涯規(guī)劃都不能對未來進行非常精確的預(yù)測，但人們可以進行環(huán)境分 析、個人條件分析，然后在此基礎(chǔ)上確定自己的目標(biāo)。第二條箴言：評判職業(yè)成功與否沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這里有一個標(biāo)準(zhǔn)可做參考，即在實現(xiàn)目標(biāo) 的過程中快樂一定要多于痛苦。第三條箴言：人的自我實現(xiàn)就是人的創(chuàng)造性潛能的充分發(fā)揮，求知是自我實現(xiàn)的前提，求美 是自我實現(xiàn)的過程。第四條箴言：職業(yè)生涯開發(fā)與管理講求的是：只要開始，永遠不晚；只要進步，總有空間。 重要的不是目前所處的位置，而是邁出下一步的方向。第五條箴言：當(dāng)你還沒有把一件工作做好的時候，就沒有資格說不喜歡；只有把工作做好了 ，甚至超過了領(lǐng)導(dǎo)的期望，你才有資格談離開的問題。第只魔戒 第一條箴言：職場革命引發(fā)了新