生物分離技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、生物分離技術(shù)綜合試驗(yàn)植物色素提取、分離及定量與初步鑒定試驗(yàn)一、 植物色素制備一、試驗(yàn)?zāi)康?理解有機(jī)溶劑提取目的物質(zhì)（植物色素）過程與注意事項(xiàng)。并理解目的物質(zhì)提取過程中主要影響因子及其互相關(guān)系。二 試驗(yàn)原理：用有機(jī)溶劑法從原料中提取黃酮類成份,利用黃酮類物質(zhì)在熱乙醇中溶解度較高,將其提取出。第1頁第1頁試驗(yàn)一、 植物色素制備三、 儀器高速干粉粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、燒杯試管若干、中低速離心機(jī)、過濾裝置（漏斗和濾紙），250ml磨口椎形瓶6個(gè)/每組；10ml容量瓶4個(gè)/組。四、試劑配40%（80ml/組）、70%（450 ml/組）乙醇，10硝酸鋁溶液50ml/組，5亞硝酸鈉50 ml/組, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2、4.3氫氧化鈉200 ml/組。第2頁第2頁試驗(yàn)一、 植物色素制備五、操作1、不同浸提劑濃度對(duì)黃酮提取率影響1.1取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用8倍體積（指料液比v/m為8：1）即20ml40%、70%，95%乙醇浸提（溫度70，時(shí)間1.5h），浸提時(shí)每隔15 min用手輕搖2min。浸提所得粗液進(jìn)行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。1.2 精密吸取上清液1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3氫氧化鈉4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置1

3、5 min，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度值，得出最優(yōu)浸提劑濃度。（按三個(gè)水平，每個(gè)水平做兩組操作，即每個(gè)單原因條件得六個(gè)數(shù)據(jù)。）第3頁第3頁試驗(yàn)一、 植物色素制備2、不同浸提時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響2.1 取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用按8：1（指料液比v/m）70%乙醇浸提（溫度70），浸提時(shí)間分別為90min、120min，150min，浸提時(shí)每隔15分鐘用手輕搖2min。浸提所得粗液進(jìn)行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。2.2 精密吸取上清液1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10硝酸鋁0

4、.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3氫氧化鈉4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度值，得出最優(yōu)浸提時(shí)間。（按三個(gè)水平，每個(gè)水平做兩組操作每個(gè)水平做兩組操作，即每個(gè)單原因條件做六個(gè)數(shù)據(jù)。）第4頁第4頁試驗(yàn)一、 植物色素制備3、不同料液比對(duì)黃酮提取率影響3.1 取干粉原料15克，分成6組（2.5克每組），用按6：1，8：1，10：1（指料液比v/m，即ml/克）70%乙醇浸提（溫度70，時(shí)間1.5h），浸提時(shí)每隔15分鐘用手輕搖2min。浸提所得粗液進(jìn)行離心（4500r/min20min），得浸提上清液。3.2 精密吸取上清液1.0 mL，分別置

5、于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3氫氧化鈉4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度值，按V*A值大小比較得出最優(yōu)料液比。選做部分：若出現(xiàn)從6：18：110：1（V*A）持續(xù)平穩(wěn)增加，則可以繼續(xù)加大料液比（可認(rèn)為12：1，14：1,）,直到找到拐點(diǎn)位置最佳料液比。 第5頁第5頁試驗(yàn)一、 植物色素制備六、試驗(yàn)注意事項(xiàng)1、將本試驗(yàn)中全部乙醇提取浸提液集中起來（一定要記下這些浸提液所對(duì)應(yīng)原料質(zhì)量M），量取其總體積V，將提取液分出50ml，將這50ml和其余

6、色素液分置于兩個(gè)燒杯中，然后將兩個(gè)燒杯在4左右低溫下并用保鮮膜封閉保留（按現(xiàn)在溫度，放在臺(tái)子上避光保留即可），以供后面純化試驗(yàn)使用。2、在色素提取過程中，每隔一段時(shí)間要進(jìn)行輕搖，搖擺時(shí)幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料損失。3、在做不同料液比對(duì)色素提取影響試驗(yàn)時(shí)，比較結(jié)果優(yōu)劣要用V*A,即：體積*吸光度值。第6頁第6頁試驗(yàn)一、 植物色素制備六、試驗(yàn)注意事項(xiàng)4、離心前一定要認(rèn)真平衡好，兩管質(zhì)量平衡誤差應(yīng)在0.1克以內(nèi)。同時(shí)，在離心過程中，一定要有專人看護(hù)以免發(fā)生事故。5、試驗(yàn)當(dāng)中提取液一定要所有從磨口錐形瓶和離心管中倒出，在將離心好色素倒出時(shí)，一定要小心，不要將底部沉降物倒出來。6、色素

7、提取過程中一定要在錐形瓶上加上塞子，若乙醇蒸發(fā)較快時(shí)（如：80%以上高濃度乙醇提取時(shí)），能夠考慮在磨口錐形瓶上加一蛇形管，但低濃度乙醇提取時(shí)沒有必要加蛇形管。第7頁第7頁試驗(yàn)一、 植物色素制備7、上樣液制備（該環(huán)節(jié)亦能夠在試驗(yàn)二中完畢）將試驗(yàn)一中所得所有浸提液用燒杯放在100水浴中濃縮到20ml，將所得濃縮液置于50ml（或更大）分液漏斗中，按等量體積加入石油醚后塞上塞子并充足搖勻，棄石油醚層，得下層黃酮液，放在90水浴中濃縮，濃縮至10ml（詳細(xì)操作時(shí)，可先用大燒杯進(jìn)行濃縮，待溶液約50ml左右時(shí)，改用50ml小燒杯進(jìn)行濃縮，這樣便于進(jìn)行定量），備用。第8頁第8頁試驗(yàn)一、 植物色素制備8、測(cè)

8、量吸光度時(shí)，一定要設(shè)空白對(duì)照（即把除1ml樣液以外其余9ml亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水+1ml乙醇）9、由于各提取液濃度較大，在測(cè)量吸光度前，一定要將待測(cè)液取出1mL，稀釋到10mL后，再按前面A值測(cè)定辦法進(jìn)行測(cè)定。第9頁第9頁試驗(yàn)一、 植物色素制備附錄1、試驗(yàn)前面準(zhǔn)備（同窗們不需要做）：（1）、原料制備用高速干粉粉碎機(jī)將銀杏葉粉碎，過40目以上，40-60目，60-70目，70-80目，80-90目，90-100目，100目以上，篩后備用。（2）、原則曲線繪制：精密稱取蘆丁對(duì)照品200 mg，用體積分?jǐn)?shù)(下同)70乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中搖勻。精密移取10 mL蘆丁乙醇液

9、于25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到0.8 mgmL原則溶液。精密吸取原則溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3氫氧化鈉4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，進(jìn)行測(cè)量，在510nm處有最大吸取波長(zhǎng)。以測(cè)定結(jié)果得蘆丁濃度與吸光度原則曲線：Y=0.1035Ad-0.0016(Y：蘆丁濃度，mgml；A：吸光值)，R =0.9999。第10頁第10頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化一、目標(biāo)學(xué)習(xí)掌握柱層析法分離純化目標(biāo)物質(zhì)（植物

10、色素）方法和操作。二、原理柱層析是比較理想分離黃酮類色素方法,其原理是經(jīng)過基質(zhì)分子與黃酮類化合物分子上酚羥基形成氫鍵締合物而產(chǎn)生作用,其作用力強(qiáng)弱取決于黃酮類化合物分子上羥基數(shù)目與位置以及洗脫劑與黃酮類化合物和基質(zhì)之間形成氫鍵締合能力大小。慣用不同百分比水和醇混合溶劑作為洗脫劑，能成功分離各種類型黃酮。第11頁第11頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化三、器材與試劑1、 試驗(yàn)儀器 層析柱、試管、燒杯、量筒、烘箱。2、 試驗(yàn)試劑 石油醚、40%乙醇200ml/組、70%乙醇300ml/組、95%乙醇200ml/組、基質(zhì)。3 、試驗(yàn)材料 銀杏葉提取液第12頁第12頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化四、操作1、上樣液

11、制備（該環(huán)節(jié)亦能夠在試驗(yàn)一中完畢）將試驗(yàn)一中所得所有浸提液用燒杯放在100水浴中濃縮到20ml，將所得濃縮液置于50ml（或更大）分液漏斗中，按等量體積加入石油醚后塞上塞子并充足搖勻，棄石油醚層，得下層黃酮液，放在90水浴中濃縮，濃縮至10ml（詳細(xì)操作時(shí)，可先用大燒杯進(jìn)行濃縮，待溶液約50ml左右時(shí)，改用50ml小燒杯進(jìn)行濃縮，這樣便于進(jìn)行定量），備用。2、基質(zhì)預(yù)處理： 稱取所需大孔吸附樹脂 (濕重)，以95乙醇浸泡24 h，充足溶脹后用乙醇濕法裝柱， 第13頁第13頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化3 裝柱：將酒精浸泡好基質(zhì)約40ml（指混勻狀態(tài)下取樣），通過漏斗緩慢倒入柱中（柱中已經(jīng)裝好10ml

12、95%乙醇），邊加邊用木夾子輕敲柱子，同時(shí)用竹簽輕輕壓實(shí)。流速應(yīng)控制在20滴/min，待裝至20cm柱高，再加與柱壁完全吻合濾紙片，接著加入1.0 cm高海沙（或石英砂）。（注意，在整個(gè)裝柱過程中，樹脂應(yīng)浸泡在溶液中，不然會(huì)出現(xiàn)斷痕，氣泡等。若柱子無砂芯，要在裝柱前加一小團(tuán)（大拇指指甲大?。┟藁ǚ庾≈樱苑阑|(zhì)漏出。）4、平衡：用95%乙醇洗柱，不時(shí)檢查流出乙醇液，待流出乙醇液與去離子水以1：3體積比混合，振搖不顯白色渾濁時(shí)結(jié)束洗柱（已洗好，不必做），用純化水將柱中樹脂洗至無醇味后備用。（注意，所有醇洗液需回收到大燒杯里，水洗液不必回收）5、上樣與吸附： 取濃縮液10ml上柱，吸附20min

13、（流速20滴/min），等樣品液完全流入基質(zhì)中后，用3倍柱體積（約150ml）去離子水洗脫。第14頁第14頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化6、洗脫（解吸附）：6.1 依次用40%200ml（流速約30滴/min）、70%300ml（流速約20滴/min）、95%200ml（流速約40滴/min）乙醇分別進(jìn)行洗脫，將試管放在試管架上按序接受洗脫液，每管搜集 8ml左右洗脫液6.2 從第一管起，每接受3管，則精密吸取第1、4、7、10等管中洗脫液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3氫

14、氧化鈉4 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度值；第15頁第15頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化6、洗脫（解吸附）：6.3 擬定黃酮所在主要流分后，將吸光度值在0.1以上（含0.1）所有管中洗脫液集中起來，測(cè)出其總體積V純化（接著，可直接測(cè)定純化液A值），預(yù)留50ml純化液，用保鮮膜封閉后放在4中低溫保留，并將其余純化液置于90水浴中濃縮至10ml，用保鮮膜封閉后放在4中低溫避光保留，備用。第16頁第16頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化五、試驗(yàn)注意事項(xiàng)1、裝柱前在柱子底部加一小棉花球。2、裝柱時(shí)，邊加樹脂邊用木質(zhì)棒（或橡膠棒）輕敲柱子，使基質(zhì)緩緩下沉 。3、裝柱要求

15、連續(xù)、均勻、無紋格、無氣泡，表面平整，整個(gè)層析過程中液面一定不得低于樹脂表面。4、要注意及時(shí)啟動(dòng)和關(guān)閉旋紐，即在上一個(gè)液體剛好沒入基質(zhì)時(shí)，才開始加入下一個(gè)液體，且一定要用玻棒引流。第17頁第17頁試驗(yàn)二、植物色素分離純化五、試驗(yàn)注意事項(xiàng)5、要注意控制流速，不宜過快。6、在加入好樣品后（在洗壁前）就要接受洗脫液。7、柱子預(yù)處理時(shí)流出液用三角瓶或燒杯接受，而上樣后色素洗脫液則用試管接受。8、所預(yù)留純化液50ml和10ml，必須是在所有洗脫下來A值不小于0.1純化液混勻后才干取液。第18頁第18頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定一、目的 用化學(xué)辦法鑒定上面所純化提取液中有黃酮存在，同時(shí)測(cè)定黃酮含量和最

16、后得率。二、原理黃酮化合物分子結(jié)構(gòu)中含有C5、C6位酚羥基或鄰二酚羥基可與金屬鹽試劑鋁鹽生成有色絡(luò)合物，黃酮絡(luò)合物在510nm處有較大吸取峰，可由分光光度法測(cè)出黃酮含量。依據(jù)黃酮一些特性，利用黃酮與一些試劑發(fā)生特殊發(fā)色反應(yīng)來檢測(cè)黃酮。第19頁第19頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定三、試驗(yàn)器材1、試驗(yàn)儀器：分光光度計(jì)，烘箱，電子天平，10ml 容量瓶1支/組，100m容量瓶1支/組，移液管若干。2、試驗(yàn)試劑： 80%氫氧化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溶液，10%FeCl3，10%FeCl2溶液，2%NaBH4溶液，甲醇。3、試驗(yàn)材料：試驗(yàn)二中所得洗脫液濃縮液（總體積為10ml）。 第20頁第20頁試驗(yàn)三、植物

17、色素定量與初步鑒定四、試驗(yàn)環(huán)節(jié)（一）物質(zhì)初步鑒定操作（樣液是試驗(yàn)二中純化液濃縮而來10ml）：1、在所純化提取液2ml中加入10%氫氧化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溶液2ml，若色素液馬上由黃色變?yōu)樯铧S色；則認(rèn)定黃酮化合物存在。2、在所純化提取液兩份，各為2ml，分別加入10%FeCl3，F(xiàn)e Cl2；若發(fā)覺兩種離子都使色素溶液變?yōu)樗{(lán)綠色，則可認(rèn)定黃酮化合物存在。3、硼酸氫鈉反應(yīng)：取黃酮純化液2ml，再加等量2%NaBH4甲醇溶液1min后加濃鹽酸（買來即用，不需調(diào)配）數(shù)滴，若有紫色或紫紅色出現(xiàn)，則闡明此黃酮純化液中有二氫黃酮存在。第21頁第21頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定（二）目的物質(zhì)得率確實(shí)定：1、

18、原則曲線及方程和最佳吸取波長(zhǎng)用試驗(yàn)一結(jié)果。2、從試驗(yàn)二所得預(yù)留在冰箱中10ml純化液中精密吸取1ml，（注意，若儲(chǔ)存液有沉降現(xiàn)象，則可進(jìn)行40 加熱，待其澄清后再進(jìn)行光度測(cè)定，但若是連續(xù)試驗(yàn)，就不必在冰箱中保留而是在試驗(yàn)二中直接測(cè)定其A值），放置于10 mL容量瓶中，冰箱中取出放置一定期間，使之達(dá)到室溫后，按前面辦法，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度值A(chǔ)。此環(huán)節(jié)亦可在試驗(yàn)二中直接測(cè)定。第22頁第22頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定（二）目的物質(zhì)得率確實(shí)定：將A樣品代入原則曲線方程Y=KA+b(Y：黃酮濃度，gL；A：吸光值，用各組自己測(cè)得方程)，能夠得到待測(cè)樣品黃酮濃度，C純化 （單位為mg/m

19、l）。C純化=Y*10*n（由于測(cè)定濃度過程中，待測(cè)液由1ml定容到10ml，n為試驗(yàn)過程中待測(cè)液稀釋倍數(shù)）黃酮得率%=測(cè)得黃酮含量（mg）/原料總質(zhì)量100% = （C純化 V純化）mg（M1000）mg100% M代表V所相應(yīng)原料總質(zhì)量。將書本公式中“V提取液/200” 去掉 ，由于試驗(yàn)二中10ml濃縮液相應(yīng)是所有提取液。第23頁第23頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定（三）目的物質(zhì)純度測(cè)定：取試驗(yàn)一中所得提取液50ml，放置在已經(jīng)烘干，并已經(jīng)稱好質(zhì)量為m1小燒杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，稱其重量m2，得色素浸膏重量為（m2 m1），再依據(jù)上面第（二）中公式算出總黃酮含量m總，則其純度為：目的物質(zhì)純化前純度= C純化50 100% m2 m1第24頁第24頁試驗(yàn)三、植物色素定量與初步鑒定（三）目的