外源基因原核表達(dá)

1、外源基因的原核表達(dá)第1頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20221外源基因表達(dá)的作用：外源基因表達(dá)泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。外源基因的表達(dá)是研究和探索基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的重要方法，也是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、診斷試劑必不可少的手段。通過外源基因的表達(dá)可由宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量的目的蛋白。第2頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20222常用的原核外源表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)第3頁，共117頁，2

2、022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20223原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：1、原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。2、基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。3、多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。第4頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20224原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：4、不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。5、內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。由于以上特點(diǎn)，近年來真核生物表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展很快，并構(gòu)建了相應(yīng)的基因表達(dá)載體。第5頁，共

3、117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20225大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。屬革蘭氏陰性細(xì)菌。其特點(diǎn)是：遺傳背景清楚目的基因表達(dá)水平高培養(yǎng)時(shí)間短第6頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20226大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要不足1、缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工過程。2、表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性3、宿主本身雜蛋白質(zhì)多，純化步驟復(fù)雜。第7頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20227大腸桿菌基因表達(dá)載體理想的大

4、腸桿菌表達(dá)載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力，在無選擇壓力下保存于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記3、轉(zhuǎn)錄可以調(diào)控，抑制時(shí)本底轉(zhuǎn)錄水平較低4、轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止且轉(zhuǎn)錄不影響載體的復(fù)制5、具備適用于外源基因插入酶切位點(diǎn)第8頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20228大腸桿菌基因表達(dá)載體構(gòu)成1、復(fù)制子：是一段包含起始位點(diǎn)和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。其功能是通過復(fù)制使載體穩(wěn)定存在于大腸桿菌細(xì)胞。第9頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20229大腸桿菌基因表達(dá)載體2、篩選標(biāo)記：大腸桿菌經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，僅有

5、少數(shù)細(xì)菌能獲得攜帶外源基因的質(zhì)粒并穩(wěn)定地傳代，篩選標(biāo)記可有效地篩選出轉(zhuǎn)化有外源基因的陽性重組。第10頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202210大腸桿菌基因表達(dá)載體3、啟動子：是與DNA依賴的RNA聚合酶相結(jié)合的一段DNA序列。啟動子是調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件，與mRNA的合成有很大關(guān)系，是表達(dá)載體不可缺少的元件。第11頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202211大腸桿菌基因表達(dá)載體4、終止子：在轉(zhuǎn)錄過程中能在特異位點(diǎn)將轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列。有兩種類型1、因子型終止子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)第12頁，共117頁，

6、2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202212第13頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202213大腸桿菌基因表達(dá)載體4、終止子： 能在特異位點(diǎn)終止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。終止子有兩種類型1、因子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)第14頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202214第15頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202215第16頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202216終止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的長度（2）、提高mR

7、NA的穩(wěn)定性（3）、避免載體上其他基因的異常表達(dá)第17頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202217大腸桿菌基因表達(dá)載體5、核糖體結(jié)合位點(diǎn)：原核細(xì)胞mRNA蛋白合成起始點(diǎn)上游的一段非編碼序列。能與30S小亞基中16S rRNA3末端的一段序列特異結(jié)合。此序列富含嘌呤，核心序列為SD序列。第18頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202218大腸桿菌基因表達(dá)載體6、密碼子：密碼子有簡并性，多個(gè)密碼子為一個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼，不同生物在利用這些密碼子時(shí)其利用頻率不同，不同的密碼子會影響到大腸桿菌的翻譯速度。第19頁，共117頁，20

8、22年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202219基因表達(dá)的機(jī)制基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。迄今為止，已構(gòu)件建了不同類型的表達(dá)系統(tǒng)，可根據(jù)需要合理地選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括：1、轉(zhuǎn)錄2、翻譯兩個(gè)環(huán)節(jié)第20頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202220基因表達(dá)的機(jī)制基因工程的核心問題：有效表達(dá)外源基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟：起始轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)的限速步驟：轉(zhuǎn)錄起始的速率構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)首先要考慮的問題是：1、選擇可調(diào)控的啟動子2、相關(guān)的調(diào)控序列第21頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202221

9、目的：在細(xì)胞生長的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定的密度時(shí)，在某種特定的誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下啟動轉(zhuǎn)錄合成mRNA。啟動子原核生物啟動子真核生物啟動子誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型組成型組成型第22頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202222mRNA的延伸與穩(wěn)定性：有效表達(dá)的關(guān)鍵是：保持mRNA的1、有效延伸2、正確終止3、mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定存在第23頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202223mRNA的有效延伸：導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的可能原因有和解決辦法1、衰減子：類似于簡單的終止子，在原核生物中一般位于操縱子的啟動子與第一

10、個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)應(yīng)避免該序列的存在。第24頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022242、非特異終止：防止非特異性終止的方法是在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)加入抗終止的序列元件。第25頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202225轉(zhuǎn)錄的正確終止也是外源基因有效表達(dá)的重要因素，可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。原核生物解決辦法真核生物解決辦法第26頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202226mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定存在：mR

11、NA在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定存在直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。解決辦法1、原核生物：選擇一個(gè)RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正確加工第27頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202227外源基因mRNA的有效翻譯為使外源基因有效翻譯，在構(gòu)建表達(dá)體系時(shí)應(yīng)考慮以下問題：1、AUG為首選起始密碼子2、SD序列為與核糖體結(jié)合位點(diǎn)3、SD序列與起始密碼子之間的距離為39個(gè)堿基4、在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)5、選擇合適的終止密碼子第28頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202228表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性常用

12、的措施有：1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)2、構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)3、構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)4、選擇蛋白水解酶基因缺陷受體系統(tǒng)第29頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202229外源基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞的位置：外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物可能存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞外培養(yǎng)基中。其表達(dá)形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白第30頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202230大腸桿菌載體的表達(dá)方式非融合表達(dá)載體融合表達(dá)載體帶純化標(biāo)簽表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體表面展示表達(dá)載體帶分子伴侶表達(dá)載體第31頁，共117頁，2022年

13、，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022311、非融合表達(dá)載體：應(yīng)用此種載體表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的細(xì)胞因子類產(chǎn)品多采用此類表達(dá)載體。2、融合表達(dá)載體：分子量較小的蛋白質(zhì)常用此類載體進(jìn)行表達(dá)。將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因閱讀框。第32頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202232在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，一般將受體菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)后其穩(wěn)定性大大增加。其原因?yàn)椋和庠葱》肿拥鞍咨系拿盖形稽c(diǎn)暴露于分子

14、的表面。當(dāng)以融合蛋白的形式表達(dá)后，外源蛋白部分在菌體自身蛋白的引導(dǎo)下正確折疊，可最大程度上封閉酶切位點(diǎn)。第33頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202233帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體：載體上具有一段特殊序列，該序列表達(dá)后可作為純化標(biāo)簽。目的基因與該序列融合表達(dá)后，用親和層析的方法很方便的將目的蛋白分離，切除標(biāo)簽序列后可得到純化的目的蛋白。第34頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202234分泌型表達(dá)載體：將目的基因與信號肽融合表達(dá)，表達(dá)蛋白在信號肽的引導(dǎo)下成為分泌蛋白。表面展示載體：將目的基因克隆到細(xì)菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)基因中，從而

15、達(dá)到細(xì)菌表面表達(dá)。帶分子伴侶的表達(dá)載體：第35頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202235第36頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202236第37頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202237第38頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202238宿主菌大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的基因一般都是異源基因，甚至是真核生物基因，而在細(xì)胞內(nèi)積累大量的異源蛋白極易被降解。造成重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因有：1、大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)；第3

16、9頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022392、大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定因子；3、大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。 由于以上原因，為使外源基因高效表達(dá)，必須構(gòu)建作為基因表達(dá)受體菌的工程菌株。第40頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202240常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)：以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。通過對大腸桿菌tac I 基因誘變，獲得能過量表達(dá)lac I 阻遏蛋白的基因突變體lac Iq，使外源基因的

17、表達(dá)調(diào)控在一定的水平。此外，目前還構(gòu)建了阻遏蛋白溫度敏感型突變體lac Iq(ts)宿主菌和載體，使lac和tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度的控制，在低溫(30oC)下基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，在(42oC)下基因的轉(zhuǎn)錄保持開放。第41頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202241常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)PL和PR啟動子表達(dá)系統(tǒng)：以噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL和PR構(gòu)建的。在野生型噬菌體中，PL和PR啟動子的轉(zhuǎn)錄與否決定噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)或溶原循環(huán)。 噬菌體PE啟動子控制的cl基因表達(dá)產(chǎn)物是PL和PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物，而其表達(dá)和在細(xì)胞中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子這間的

18、復(fù)雜平衡關(guān)系。通過細(xì)胞因子調(diào)節(jié)cl在細(xì)胞中含量的途徑很難操作，因此在構(gòu)建表達(dá)體系時(shí)，選用溫度敏感突變體cl1857(ts)的基因產(chǎn)物調(diào)控PL和PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。第42頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202242常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)T7表達(dá)體系：利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的，具有很高表達(dá)能力的表達(dá)系統(tǒng)。T7噬菌體RNA聚合酶能選擇性地激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄，這是一種活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相當(dāng)于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。在大腸桿菌宿主細(xì)胞中，受T7噬菌體啟動子控制的基因在T7噬菌體RNA聚合酶存在下進(jìn)行高表達(dá)。第43頁

19、，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202243常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株 菌株 基因型 啟動子 BL 21 hsd S gal T 7噬菌體 HMS174 recA1 hsdR rif T 7噬菌體 M5279 lacZ trpA rpsL 噬菌體PL RB791 W3110 lacIq L8 lac,tac第44頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202244大腸桿菌高效表達(dá)目的基因策略對表達(dá)相關(guān)元件進(jìn)行優(yōu)化提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過程提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性第45頁，共1

20、17頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202245表達(dá)相關(guān)元件的優(yōu)化主要包括與表達(dá)相關(guān)的啟動子序列和決定mRNA翻譯的SD序列。具體方法為組合強(qiáng)啟動子和強(qiáng)終止子；增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補(bǔ)配對的堿基序列；調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近序列轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。第46頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202246表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼 ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對 mRN

21、A 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高36倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 68 個(gè)堿基長度， 與 AAGAA 的最適距離是57 個(gè)堿基長度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個(gè)堿基； mRNA 的翻譯才能進(jìn)行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效 率較高。第47頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202247 核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因 mRNA 5 端的二級結(jié)構(gòu)，

22、研究表明討 mRNA 5端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)阻礙了 mRNA 與核糖體 30S 亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。 盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低 mRNA 5 端形成的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。 在必要的情況下，還可通過定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來破壞 mRNA 5 端的 “莖環(huán)” 結(jié)構(gòu) 。 把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè) SD 序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5 端序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下第48頁，共11

23、7頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202248表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列 能提高 mRNA 翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強(qiáng)子 。 第49頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202249提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用簡并密碼子的使用頻率不同與相應(yīng)tRNA在細(xì)胞中的豐度有關(guān)。過多使用低豐度tRNA時(shí)，會因tRNA耗盡而影響翻譯?？蓪⑼庠椿蛑型x密碼子進(jìn)行點(diǎn)突變，成為受體菌中常用密碼子而提高表達(dá)能力。第50頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星

24、期四10/11/202250共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達(dá)水平低的基因。 現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、AGG、CGA、CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、CCU、CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、UGC; 編碼 Gly 的密碼子 GGA、GGG 編碼 Leu 的密碼子 CUA、CUC 編碼 Ile 的密碼子 AUA 編碼 Ser 的密碼子 UCA、AUG、UCG、UCC 編碼 Thr 的密碼子 ACA四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第51頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分

25、，星期四10/11/202251共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA 的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。 解決這一問題的辦法： 通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子 tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞 內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第52頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202252提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘

26、導(dǎo)下，其蛋白水解酶的活性可能會增加。因此必需提高外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法有： 1、將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中； 2、選用某些蛋白水解酶缺陷株； 3、對外源蛋白中水解酶敏感的序列進(jìn)行修飾或改造； 4、在表達(dá)外源蛋白的同時(shí)，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。第53頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202253提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性：大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識別外源DNA或RNA并對其進(jìn)行降解。為了保持外源mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可采取兩種措施：1、盡可能減少核酸外切酶對外源基因mRNA的降解；2、改變外源基因mRNA

27、的結(jié)構(gòu)，使之不易被酶降解。第54頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202254提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。第55頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202255提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。 對分子量較小的目

28、標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)。 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。 對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點(diǎn)進(jìn)行改造。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。第56頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202256 但必須指出的是，由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活

29、力降低，甚至沒有活性。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。第57頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202257優(yōu)化發(fā)酵過程：工藝的優(yōu)化生物學(xué)因素的優(yōu)化第58頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202258工藝的優(yōu)化擴(kuò)大培養(yǎng)的條件優(yōu)化反應(yīng)器的優(yōu)化第59頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202259生物

30、學(xué)因素的優(yōu)化溶氧量pH值溫度培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的混合情況第60頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202260四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 第61頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202261構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，

31、培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。 雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補(bǔ)料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實(shí)際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。第62頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202262芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌是對人畜無害的革蘭氏陽性土壤微生物。細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白到胞外，

32、目前已成為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種。第63頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022631、多為非致病性微生物2、培養(yǎng)條件簡單，生長迅速3、表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性4、遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作5、培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)比較成熟第64頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202264芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足1、芽孢桿菌分泌的蛋白酶量大、種類多，對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性形成很大威脅2、載體不穩(wěn)定，易造成外源基因的丟失第65頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四

33、10/11/202265芽孢桿菌表達(dá)載體復(fù)制子：目前廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌表達(dá)載體的復(fù)制子有：1、來源于金色葡萄球菌的復(fù)制子如pUB110、pC194和pE194等質(zhì)粒表達(dá)載體。2、來源于小芽孢桿菌的復(fù)制子如pHY481、pWT481等。第66頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202266芽孢桿菌表達(dá)載體啟動子：在利用芽孢桿菌表達(dá)體系時(shí)，必需使用芽孢桿菌能夠識別的啟動子。芽孢桿菌含有多種轉(zhuǎn)錄起始識別因子()，在芽孢桿菌中已鑒定的 已達(dá)十種。啟動子可被特異的 因子識別。芽孢桿菌啟動表達(dá)具有明顯的時(shí)序性，與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關(guān)。第67頁，共117頁，

34、2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202267表達(dá)載體：1、自主復(fù)制質(zhì)粒芽孢桿菌的自主復(fù)制質(zhì)粒大多為無抗性標(biāo)志的隱蔽質(zhì)粒。帶有抗性標(biāo)志的自主復(fù)制質(zhì)粒主要來自其它革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在這些質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙標(biāo)記質(zhì)粒等載體。自主復(fù)制質(zhì)粒不穩(wěn)定，在復(fù)制過程中易發(fā)生丟失。第68頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022682、整合質(zhì)粒：在大腸桿菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加一個(gè)芽孢桿菌的抗性標(biāo)志，以及待整合的目的基因。因其沒有芽孢桿菌的復(fù)制子，不能自主復(fù)制，整合到芽孢桿菌染色體后，隨細(xì)胞復(fù)制而復(fù)制。3、噬

35、菌體：105、SP及其它噬菌體均可作為芽孢桿菌的表達(dá)載體。其中105是一種溫和噬菌體。第69頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202269宿主菌：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，因此在構(gòu)建芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)宿主菌時(shí)要將蛋白酶基因進(jìn)行突變，使其滅活或?qū)⒒钚越档?。目前?yīng)用較多的宿主菌主要有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。第70頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202270枯草芽孢桿菌能分泌6種不同的胞外蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶及中性蛋白酶A和B。對

36、其中35種胞外蛋白酶基因進(jìn)行突變，可將胞外蛋白酶的活性降低至原來的1；若將6種胞外蛋白酶基因全部突變，則胞外蛋白酶活性可降至原來的0.3%左右。第71頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202271短小芽孢桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：1、能對許多蛋白質(zhì)進(jìn)行分泌表達(dá)2、胞外蛋白酶活性較低3、短小芽孢桿菌分泌胞外蛋白酶的同時(shí)還能產(chǎn)生蛋白酶抑制劑，不同短小芽孢桿菌分泌抑制劑的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差異很大第72頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022724、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)由三層組成，最外兩層為蛋白層，內(nèi)層為肽聚糖。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞

37、的生長周期有關(guān)。在生長穩(wěn)定前期，細(xì)胞壁的外層和中層蛋白開始從細(xì)胞表面脫落，分泌型蛋白開始表達(dá)；進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞壁的蛋白層全部脫落，細(xì)胞壁蛋白仍然表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞壁蛋白在培養(yǎng)基中大量累積。第73頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022735、利用細(xì)胞壁蛋白基因的啟動區(qū)、操縱區(qū)、翻譯起始區(qū)和蛋白質(zhì)信號肽序列等元件表達(dá)外源基因，可使 外源基因在小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效分泌表達(dá)。第74頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202274芽孢桿菌中高效表達(dá)的策略1、提高表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性：以金黃色葡萄球菌為基礎(chǔ)構(gòu)建的一系列質(zhì)粒在

38、進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制時(shí)會產(chǎn)生許多單鏈DNA，這些單鏈DNA的存在會對質(zhì)粒DNA造成影響，在沒有選擇壓力的情況下易發(fā)生丟失；某些表達(dá)質(zhì)粒載體還含有染色體DNA同源序列，在細(xì)胞分裂的過程中可發(fā)生同源交換，導(dǎo)致質(zhì)粒的消失。第75頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022752、構(gòu)建新型的表達(dá)質(zhì)粒：通過消除表達(dá)載體中與宿主菌染色體DNA的同源序列3、構(gòu)建整合型質(zhì)粒：利用質(zhì)粒中與染色體的同源序列構(gòu)建整合型質(zhì)粒，使目的基因整合到染色體上4、滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶第76頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202276鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌是一類好氧

39、、絲狀的革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛存在于土壤中，能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。鏈霉菌的染色體為線狀結(jié)構(gòu)，在中間含有復(fù)制起始點(diǎn)和共價(jià)結(jié)合的末端蛋白，DNA不穩(wěn)定，有時(shí)會出現(xiàn)缺失而環(huán)化，但對細(xì)菌生長沒有嚴(yán)重影響。第77頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202277鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)；1、為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素2、可進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)3、可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調(diào)控體系，表達(dá)外源蛋白的時(shí)間較長4、鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)第78頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022

40、78鏈霉菌表達(dá)載體啟動子：鏈霉菌基因啟動子的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為多樣性，至少存在三類鏈霉菌基因啟動子：1、與大腸桿菌基因10區(qū)和35區(qū)類似的啟動子，10區(qū)堿基序列通常為5TAGPuPuT3，35區(qū)堿基序列 為5TTGCPu3，這種啟動子序列可被大腸桿菌RNA聚合酶識別，這類啟動子一般在細(xì)菌對數(shù)生長期啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。第79頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022792、僅與大腸桿菌基因10區(qū)類似的啟動子。3、與大腸桿菌基因10區(qū)與35區(qū)序列均不相同的啟動子。終止子：鏈霉菌基因終止子結(jié)構(gòu)具有較長的不完全互補(bǔ)反向重復(fù)序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在多數(shù)情況下不含寡聚T序列，轉(zhuǎn)

41、錄終止位點(diǎn)位于終止子結(jié)構(gòu)下游的鄰近區(qū)域第80頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202280核糖體結(jié)合位點(diǎn)：鏈霉菌基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列類似于其他原核生物的SD序列：5(a/g)GGAGG3相對于其他革蘭氏陽性細(xì)菌而言，鏈霉菌基因中核糖體序列的保守性略低，與起始密碼之間的距離為512個(gè)堿基。鏈霉菌基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼區(qū)之間的距離變化也較大，從數(shù)個(gè)bp到幾百個(gè)不等。第81頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202281密碼子：鏈霉菌對編碼蛋白質(zhì)的密碼子具有明顯的偏愛性。對數(shù)十種鏈霉菌蛋白質(zhì)的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白質(zhì)的堿

42、基序列中GC的平均含量高達(dá)73，密碼子的第一、第二和第三位堿基的GC含量分別為66、53和93。有些簡并密碼子的使用頻率不足2。第82頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202282鏈霉菌表達(dá)載體1、高拷貝載體：普遍采用的是pIJ101，在鏈霉菌中的拷貝數(shù)為40800。通常加入硫鏈絲霉素、紅霉素、紫霉素和新霉素作為抗性選擇性標(biāo)記。pIJ702是pIJ101的衍生質(zhì)粒，含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作為選擇性標(biāo)記。外源基因可插入滅活mel基因，因不產(chǎn)生黑色素而非常方便使用。第83頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20228

43、32、低拷貝載體：由SCP2*衍生的質(zhì)粒pIJ922和940等，可接受較大的外源基因，但只有12個(gè)拷貝。3、穿梭質(zhì)粒載體：可在大腸桿菌中完成構(gòu)建和復(fù)制，在鏈霉菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。4、噬菌體載體第84頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202284宿主菌：鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌主要有變鉛青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。天藍(lán)色鏈霉菌是整個(gè)霉菌中分子遺傳學(xué)研究最清楚的菌株，但有較強(qiáng)的修飾系統(tǒng)，因而在實(shí)際應(yīng)用中都是以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體菌系統(tǒng)。第85頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202285變鉛青鏈霉菌表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)

44、1、遺傳背景清楚，不含內(nèi)源性質(zhì)粒2、對外源DNA無明顯的修飾作用3、能夠高效表達(dá)鏈霉菌基因以外的其他基因；4、具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。第86頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202286在鏈霉菌中高效表達(dá)外源基因的策略影響外源基因在鏈霉菌中表達(dá)的因素包括：啟動子的特性信號肽的序列基因的結(jié)構(gòu)和發(fā)酵條件等第87頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202287啟動子的影響：鏈霉菌RNA聚合酶能識別某些原核生物的啟動子，但不能識別真核生物基因的啟動子，因此表達(dá)真核生物基因時(shí)要采用鏈霉菌的啟動

45、子。為高效表達(dá)要對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇透脑臁Ｈ缭趩幼拥?0區(qū)和35區(qū)內(nèi)插入GC堿基對可明顯提高外源基因的轉(zhuǎn)錄效率；將ermE啟動子中缺失3個(gè)堿基對，可使基因啟動轉(zhuǎn)錄的效率大大增加。第88頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202288信號肽序列：針對要表達(dá)的外源蛋白對信號肽序列進(jìn)行優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效分泌表達(dá)的重要途徑。在信號肽N區(qū)的電荷數(shù)增加或減少可使分泌表達(dá)的效率成倍的增加或降低；信號肽與目的蛋白的距離也影響到外源蛋白的分泌。信號肽只影響分泌與否而不影響表達(dá)的效率。第89頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202289基

46、因結(jié)構(gòu)的影響：1、密碼子的影響：應(yīng)盡可能不出現(xiàn)鏈霉菌中的稀有密碼子。鏈霉菌中翻譯的起始密碼子一般為ATC或GTC,終止密碼為TAA或TAG。2、SD序列：不同的宿主其SD序列不同，針對不同的鏈霉菌對SD序列進(jìn)行改造或修飾以提高外源基因的表達(dá)。第90頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022903、終止子：選擇合適的終止子可提高RNA聚合酶的利用率和增加mRNA的穩(wěn)定性發(fā)酵條件：包括發(fā)酵工藝、培養(yǎng)基組分、各種環(huán)境因素如溫度、pH值和溶氧等一系列相關(guān)條件，這些條件的確定須經(jīng)實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索。第91頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/

47、202291藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻是近年來迅速發(fā)展起來的一種很好的表達(dá)系統(tǒng)，藍(lán)藻含有葉綠素和藻膽色素，具有光合系統(tǒng)，進(jìn)行光合作用。藍(lán)藻還具有原核生物的特征，無細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體DNA裸露，是典型的原核生物。第92頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202292藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)為：1、基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA檢測；2、細(xì)胞壁為革蘭氏陰性，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化；第93頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30

48、分，星期四10/11/2022933、營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機(jī)鹽、水和適宜的溫度；4、多種藍(lán)藻含有內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件；5、藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無毒，經(jīng)常作為食品或保健品的添加劑。第94頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202294藍(lán)藻外源基因表達(dá)載體為使外源目的基因的有效轉(zhuǎn)化及表達(dá)，已構(gòu)建了一系列穿棱質(zhì)粒表達(dá)載體和基因整合平臺系統(tǒng)，如：pZL、pPKE2、pPKET等。在這些表達(dá)載體上組裝了多種含有不同啟動子的基因表達(dá)盒。應(yīng)用較多的有噬菌體PL和PR啟動子及藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白cpcB2A2操縱子啟動子和熱

49、休克基因groESL等。第95頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202295在藍(lán)藻細(xì)胞中高效表達(dá)外源目的基因的策略1、構(gòu)建在藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定性好的表達(dá)載體系統(tǒng)：現(xiàn)已構(gòu)建了松馳質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒，在細(xì)胞中有較高的基因拷貝數(shù)，提高了目的基因高效表達(dá)的可能性。第96頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022962、重組穿梭質(zhì)粒在藍(lán)藻細(xì)胞中通常是很不穩(wěn)定的，在缺選擇壓力的培養(yǎng)條件下很容易丟失，導(dǎo)致目的基因表達(dá)的不穩(wěn)定性。近年來以藍(lán)藻染色體DNA的非必需序列區(qū)為基因整合平臺，構(gòu)建相應(yīng)的供體質(zhì)粒表達(dá)載體，通過同源重組將目的基因整合

50、到藍(lán)藻染色體上保證其穩(wěn)定。第97頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022973、組裝含強(qiáng)啟動子的外源表達(dá)盒。4、外源基因融合表達(dá)：近年來開發(fā)了泛素融合表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)藍(lán)藻、大腸桿菌及酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明，目的基因泛素基因融合表達(dá)可大大提高目的基因的表達(dá)量，并且?guī)缀跛蟹核厝诤闲问疆a(chǎn)生的蛋白質(zhì)都是具有活性的，同時(shí)，泛素還可被作為分離標(biāo)簽。第98頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202298基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分離純化外源基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。因此，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測過程就是對特異性mRNA和蛋白質(zhì)的檢測。對mRN

51、A檢測的主要方法為Northern雜交法，檢測特異性蛋白質(zhì)的方法包括生化反應(yīng)檢測法、免疫學(xué)檢測法和生物學(xué)活性檢測法等。第99頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/202299外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞后可能有的命運(yùn)是：1、外源基因與表達(dá)載體一起游離于染色體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄2、外源基因整合到染色體上并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄3、外源基因整合到染色體上后不轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為基因沉默第100頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022100Northern雜交檢測mRNA步驟：1、提取總RNA2、分離mRNA(利用親和層析的原理純化)3、制備R

52、NA探針。(根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針或以cDNA探針)4、Northern雜交第101頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022101報(bào)告基因的酶法檢測報(bào)告基因的特點(diǎn)1、表達(dá)產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中不存在2、報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物便于檢測第102頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022102基因工程中使用的報(bào)告基因：1、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)：催化乙酰輔酶A中的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上而使氯霉素失活。真核生物細(xì)胞中不含CAT，重組后細(xì)胞產(chǎn)生氯霉素抗性。CAT的活性可以通過反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或乙氯

53、霉素的增加表示。第103頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022103基因工程中使用的報(bào)告基因：2、-葡萄糖苷酯酶基因(GUS)編碼產(chǎn)物催化-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。大多數(shù)植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和真菌中都不存在內(nèi)源GUS活性而廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因。另外常用的報(bào)告基因有二氫葉酸還原酶、胸苷激酶、熒光素酶等第104頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022104免疫學(xué)檢測：是基因表達(dá)產(chǎn)物檢測中最常用的方法之一。以表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，通過與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)來確定基因表達(dá)的情況。主要方法有1、免疫沉淀法 2、酶聯(lián)

54、免疫吸附法 3、Westhern印跡法 4、固相放射免疫法等第105頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022105免疫沉淀法的過程 1、對靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記：通常以同位素35S標(biāo)記靶蛋白，在培養(yǎng)基中加入35S的蛋氨酸和半胱氨酸的混合物，通過代謝過程使哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記上放射性同位素。 2、細(xì)胞裂解釋放靶抗原 3、靶蛋白的免疫沉淀 將抗靶蛋白的特異性抗體加入到細(xì)胞裂解液中形成抗原-抗體復(fù)合物并回收。第106頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/20221064、將回收的靶蛋白在反應(yīng)試管中與蛋白抗體，使之與靶蛋白結(jié)合并形成沉淀。 5、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析第107頁，共117頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)30分，星期四10/11/2022107酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 1、抗體制備：ELISA檢測中的抗體包括普通抗體和酶標(biāo)記抗體，其中酶標(biāo)記的抗體又分為針對特異抗原的酶標(biāo)一抗和針對一抗的酶標(biāo)二抗 2、抗體或抗原的包被：通過物理吸附法和共價(jià)交聯(lián)法等將抗原或抗體固定在固相載體的表面第108頁，共117頁，2022年，5月20日，