微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-8微生物菌種誘變

實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庹T變劑對(duì)微生物的殺菌和誘變的雙重生物學(xué)效應(yīng)。學(xué)習(xí)紫外線誘變的方法及測(cè)定誘變劑最適量的方法。實(shí)驗(yàn)原理

突變可分為自然突變和誘變突變，許多物理因素、化學(xué)因素和生物因素對(duì)微生物都有誘變作用，能使突變率提高到自發(fā)突變水平以上的因素稱為誘變劑。紫外線誘變紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素，UV的生物學(xué)效應(yīng)主要是它能引起DNA的結(jié)構(gòu)變化，主要作用是使DNA同一條鏈上相鄰的T（胸腺嘧啶）形成二聚體，阻礙雙鏈解旋， 及堿基的正常配對(duì)，從而引起突變。?

紫外線的波長(zhǎng)在200~380

nm之間，但對(duì)誘變最有效的波長(zhǎng)僅僅是在253~265

nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254nm。DNA損傷或突變后，可被光激活酶所修復(fù)，故一

般要求操作應(yīng)在紅光下進(jìn)行，處理后在暗處培養(yǎng)。隨著照射時(shí)間的增長(zhǎng)，殺菌率和突變率隨之提高，但照射時(shí)間繼續(xù)增加到一定程度時(shí)，其殺菌率隨之增大，而突變率卻降低。紫外線誘變紫外線誘變紫外線照射劑量、強(qiáng)度單位為

/mm2，由于測(cè)定 ，在實(shí)際誘變育種中常用UV照射時(shí)間或致死率表示相對(duì)劑量（其中以致死率表示具有實(shí)際意義）。以致死率表示相對(duì)劑量以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，以致死率為縱坐標(biāo)，突變率為最高值，相應(yīng)的致死率即為最適劑量計(jì)數(shù)：根據(jù)對(duì)照平板上cfu數(shù)，計(jì)算出每單位體積（ml）菌液中的cfu數(shù)，同樣計(jì)算出紫外線處理1min和3min后的cfu數(shù)及致死率。存活率和致死率存活率（%）=處理后每毫升cfu數(shù)/對(duì)照每毫升cfu數(shù)*100?

致死率（%）=（對(duì)照每毫升cfu數(shù)—處理后每毫升cfu數(shù)）/對(duì)照每毫升cfu數(shù)*100誘變育種過(guò)程指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。2個(gè)主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機(jī)）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活 中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來(lái)。（一）出發(fā)菌株（original

strain）出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。?

出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等）；對(duì)誘變劑敏感?

出發(fā)菌株的來(lái)源：野生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株（二）菌懸液的選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：①使每個(gè)細(xì)胞能均勻接觸誘變劑；②減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及

現(xiàn)象）同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）菌齡：對(duì)誘變劑最敏感時(shí)期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞：對(duì)數(shù)期孢子或芽孢：萌發(fā)前期4.菌懸液的 方法5.菌懸液的濃度物理誘變：生理鹽水配制化學(xué)誘變：緩沖液配制酵母菌，霉菌的孢子：106個(gè)/mL細(xì)菌，放線菌孢子：108個(gè)/mL（三）誘變劑的選擇及處理方法1.誘變劑的選擇（高效，簡(jiǎn)便）?

物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡(jiǎn)便；

?

化學(xué)誘變劑：頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。?

(

NTG——超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑2.劑量的選擇?

常以殺菌率來(lái)表示相對(duì)劑量（劑量-存活率曲線）?

最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動(dòng)的劑量。?

突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量,反而會(huì)使突變率下降。?

正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。?

在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對(duì)殺菌率為70~75%,甚至30~70%的劑量。?

UV的劑量:固定UV功率和照射距離,以照射時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)確定劑量多少。3.

誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理：①同一誘變劑的重復(fù)使用；②兩種或多種誘變劑的先后使用；③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.（五）突變株的篩選初篩（以量為主）

方法需簡(jiǎn)便、快速利用形態(tài)變異：需預(yù)先測(cè)定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選?

透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；?

抑菌圈法（抗生素）；?

變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；?

沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測(cè)定）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測(cè)所需產(chǎn)物誘變育種的基本原則：?

選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑；?

挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；?

處理單細(xì)胞或單孢子懸液；?

選用最適的誘變劑量；?

充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)；?

利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)；?

設(shè)計(jì)高效篩選方案；?

創(chuàng)造新型篩選方法。出發(fā)菌株（純化）前培養(yǎng)（培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期）菌懸液活菌計(jì)數(shù)誘變預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劑量存活率曲線）誘變處理（相對(duì)殺菌率為70-75%，30-70%活菌計(jì)數(shù)中間培養(yǎng)（培養(yǎng)過(guò)夜，克服表型延遲）突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗(yàn)菌種（鑒定與）保藏技術(shù)路線：實(shí)驗(yàn)材料枯草芽孢桿菌無(wú)菌培養(yǎng)皿1ml移液管牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布棒紫外燈生理鹽水實(shí)驗(yàn)任務(wù)1皿對(duì)照

1皿1min1皿2min1皿3min4只皿加0.5ml菌懸液涂布，照射。注意?

涂板要涂均勻，否則會(huì)產(chǎn)生中間一片分不開(kāi)菌落數(shù)據(jù)結(jié)果處理10秒20秒30秒對(duì)照稀釋倍數(shù)菌落數(shù)存活率/%致死率/%生理生化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備材料葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基（溴甲酚紫指示劑）：300ml分裝70支試管并放置小管乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（溴甲酚紫指示劑）：300ml分裝70試