開題報(bào)告-錢深課件VIP

微生物法生產(chǎn)煙酰胺高活性菌株的選育姓名：錢深導(dǎo)師：楊生玉1.課題研究背景

煙酰胺是輔酶I和輔酶Ⅱ等的組成部分之一,參與機(jī)體多種氧化還原反應(yīng),醫(yī)學(xué)上用于治療糙皮病、口炎、舌炎、肝臟疾病及日光性皮炎;大劑量可降低膽固醇和甘油三酯,其生理作用與煙酸相仿,但水溶性較好,無明顯擴(kuò)張血管作用。據(jù)了解,近幾年國(guó)外煙酰胺產(chǎn)品價(jià)格比較穩(wěn)定,始終穩(wěn)定在815～915美元/kg。我國(guó)的煙酰胺生產(chǎn)技術(shù)處于開發(fā)和發(fā)展中,生產(chǎn)廠家較少且生產(chǎn)技術(shù)落后,規(guī)模小、產(chǎn)量低、成本高,原料難以得到且質(zhì)量不穩(wěn)定。年產(chǎn)量800t左右,幾年來產(chǎn)量和生產(chǎn)能力一直變化不大,無法滿足市場(chǎng)的需求,更無法使產(chǎn)品打入國(guó)際市場(chǎng)。煙酰胺又稱尼克酰胺，維生素B3，(Nicotinamide),分子量122.13，熔點(diǎn)128~131℃，比重1.400.易溶于水、醇、甘油。在空氣中穩(wěn)定，不吸潮。為白色粉末,無臭,帶苦味。干燥狀態(tài)50℃以下極穩(wěn),與無機(jī)酸和堿一起加熱則水解成煙酸。易溶于水、丙酮、氯仿、丁醇等。簡(jiǎn)稱VB3或NSA,微毒，LD=2500～3500mg/kg(大鼠皮下為1700mg/kg)。分子式C6H6N2O,分子量1221.13,結(jié)構(gòu)式為:煙酰胺有三種商品規(guī)格，即食品級(jí)、飼料和醫(yī)藥級(jí)。主要作為飼料的營(yíng)養(yǎng)性添加劑（水溶性維生素），也用于食品、醫(yī)藥、染料的中間體，同時(shí)用作電鍍液的添加劑和生化試劑。其應(yīng)用分別為飼料添加劑40～50﹪,食品添加劑25～30﹪，醫(yī)藥和其它方面20～25﹪。合成方法主要有：化學(xué)法（MPDA法、乙醛法或丙烯醛法、3-氰基吡啶水解法、煙酰胺脫水法）；生物合成法（腈水合酶水解法）。檢測(cè)方法主要有Ph指示劑吸收度比值法、RP-HPLC熒光檢測(cè)法、紫外分光光度法、近紅外光譜法、HPLC法。2.研究目標(biāo)通過誘變獲取腈水合酶高產(chǎn)菌株。找到適合發(fā)酵主要產(chǎn)物（煙酰胺）測(cè)定的方法和提取工藝。菌株的活化菌株的誘變菌株的篩選與保藏種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得高活性菌體腈水合酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定及轉(zhuǎn)化率的計(jì)算保藏轉(zhuǎn)化率高的菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)4.實(shí)驗(yàn)過程流程圖菌株活化：經(jīng)平板培養(yǎng)挑選菌落形態(tài)較為優(yōu)勢(shì)的單菌落，然后轉(zhuǎn)接至斜面。菌株誘變：出發(fā)菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體收集菌體無菌生理鹽水洗滌并重懸UV照射避光冷藏24h稀釋涂布于平板培養(yǎng)基挑取形態(tài)較大的單菌落搖瓶復(fù)篩突變菌株斜面保藏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)36h4000rpm離心20min照射時(shí)間為存活率在30%左右的時(shí)間28℃4天腈水合酶催化反應(yīng)：在經(jīng)29℃恒溫的19mL磷酸緩沖液(pH值7.O，O.1mol/L)中加入1mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的菌體和1mL一定濃度的煙腈溶液，在28℃的搖床中反應(yīng)15min，用lml．4mol/L鹽酸終止反應(yīng)，在6000r/min下離心20min，取上清液,對(duì)反應(yīng)液中產(chǎn)物煙酰胺進(jìn)行檢測(cè)。遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：將誘變后的突變株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次，分別發(fā)酵測(cè)定每一代的生物量和轉(zhuǎn)化率。5.已完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容種子液中菌株生長(zhǎng)曲線（200rpm，28℃）5.1發(fā)酵液中菌株生長(zhǎng)曲線（200rpm，28℃）5.25.3產(chǎn)物檢測(cè)方法應(yīng)用高鐵鹽配位-分光光度法測(cè)定煙酰胺的含量原理：煙酰胺結(jié)構(gòu)中的酰胺基能與羥胺在堿性條件下生成異羥肟酸，生成物與高鐵離子發(fā)生配位反應(yīng)，生成紫紅色配合物，在波長(zhǎng)496nm處有最大吸收，在一定范圍內(nèi)，吸光度與煙酰胺濃度呈線性關(guān)系，可通過測(cè)定異羥肟酸鐵的吸光度來測(cè)定煙酰胺的含量。實(shí)驗(yàn)方法：取煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)液2.0ml，鹽酸羥胺試液2.0ml于25ml比色管中，于60℃水浴中加熱60min，取出冷卻，加三氯化鐵試液2.0ml，靜置10min后，用水稀釋至刻度，以水為空白，在496nm處測(cè)定其吸光度A。高鐵鹽配位-分光光度法缺陷1.只適用于標(biāo)準(zhǔn)品或純品的測(cè)量。2.此方法使底物（煙腈）與產(chǎn)物（煙酰胺）都顯色，在496nm處都有很強(qiáng)的吸收峰。查找到的其他檢測(cè)方法大多是針對(duì)純品的檢測(cè)，無法在本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，而唯一有效地方法為HPLC。5.4產(chǎn)物檢測(cè)方法初探5.4.1主要采用GC-2014C（島津氣相色譜儀）對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)。進(jìn)樣量：0.5μL

條件編號(hào)氣化室溫度柱溫檢測(cè)溫度1150℃120℃150℃2220℃170℃220℃3220℃150℃220℃條件編號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果原因分析1煙腈、煙酰胺及其混合物拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，而且混合物不能分離。1.氣化室溫度低2.柱溫低2拖尾現(xiàn)象得到改善，但兩物質(zhì)出峰時(shí)間一致。1.氣化室溫度高2.柱溫過高3拖尾現(xiàn)在明顯，混合物不能分開。1.柱溫低5.4.2利用薄層層析法對(duì)3-氰基吡啶與煙酰胺進(jìn)行分離和定性分析。（參考文獻(xiàn)：煙腈水解中3-氰基吡啶、煙酰胺及煙酸的薄層掃描定量法）所需器材及藥品：硅膠GF254、玻璃板、展開槽、點(diǎn)樣管及3-氰基吡啶（分析純）、煙酰胺（分析純）、煙酸（分析純）展開劑：苯-氯仿-甲醇-二乙胺-水（1.5:2:0.5:0.05:0.05V/V）方法概述：用硅膠GF254制板，活化后點(diǎn)樣，在展開劑中展層，距離薄板上端1cm處停止，烘干后在254nm紫外燈在觀察。試驗(yàn)結(jié)果：層析板中三種物質(zhì)的Rf值3-氰基吡啶>煙酰胺>煙酸試驗(yàn)結(jié)果：標(biāo)樣3-氰基吡啶、煙酰胺及兩者混合液在同一層析板上展層