-基因工程操作技術(shù)課件

Chapter4DNA操作技術(shù)Chapter4DNA操作技術(shù)1 DNA操作技術(shù)主要有：切割、連接、縮短、加長、轉(zhuǎn)錄成RNA，或者合成新的DNA，化學(xué)修飾、或者去掉特殊的化學(xué)基團(tuán)。

DNA操作技術(shù)主要有：切割、連接、縮短、加長、轉(zhuǎn)錄成RNA2學(xué)習(xí)內(nèi)容：DNA操作酶

核酸酶連接酶聚合酶DNA修飾酶限制性內(nèi)切酶分類和命名酶切體系、反應(yīng)條件、結(jié)果鑒定定位酶切位點(diǎn)連接學(xué)習(xí)內(nèi)容：DNA操作酶31.1核酸酶作用：降解磷酸二酯鍵分為：外切酶內(nèi)切酶1.DNA操作酶1.1核酸酶1.DNA操作酶41.1核酸酶Bal31(來自于細(xì)菌Alteromonasespejiana)單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，雙鏈特異的外切酶活性。依賴于Ca2+用途： 構(gòu)建限制酶圖譜 產(chǎn)生末端缺失突變 DNA超螺旋線性化1.1核酸酶Bal31(來自于細(xì)菌Alteromona51.1核酸酶來自于真菌Aspergillusoryzae的S1內(nèi)切酶作用于單鏈DNA或RNA。用途：

分析內(nèi)元的位置 獲得平端ds-DNA 酶量大時(shí)， 降解雙鏈DNA1.1核酸酶來自于真菌Aspergillusoryza61.1核酸酶來自于牛胰腺的DNaseI既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產(chǎn)生單核苷酸或短鏈。DNAFingerprintingwithDNaseI1.1核酸酶來自于牛胰腺的DNaseI既可以降解單鏈也71.1核酸酶RNaseH（E.coli）降解RNA:DNA雜交分子中的RNA。1.1核酸酶RNaseH（E.coli）81.2連接酶連接3‘端羥基和5’端磷酸形成磷酸二酯鍵。在DNA復(fù)制、修復(fù)、以及 體外重組 過程中起 重要作用。1.2連接酶連接3‘端羥基和5’端磷酸形成磷酸二酯鍵。在91.2連接酶T4-DNA連接酶連接粘性末端、平端修復(fù)雙鏈DNA或RNA-DNA雜交雙鏈上的缺口。E.coliDNA連接酶連接粘性末端（主要用于cDNA第二鏈的合成）1.2連接酶T4-DNA連接酶101.3聚合酶DNA聚合酶I5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性核酸內(nèi)切酶活性可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。1.3聚合酶DNA聚合酶I111.3聚合酶1.3聚合酶121.3聚合酶Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的粘端標(biāo)記DNA探針催化cDNA第二條鏈的合成末端終止法測序1.3聚合酶Klenow酶131.3聚合酶T4DNA聚合酶與Klenow酶相似，外切酶活性更高。體外誘變反應(yīng)中效率很高。T7DNA聚合酶測序酶TaqDNA聚合酶1.3聚合酶T4DNA聚合酶141.3聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney鼠白血病病毒）1.3聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA151.3聚合酶兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別肽鏈的組成禽酶2條肽鏈，具聚合酶和很強(qiáng)的RNaseH活性鼠酶1條，較弱的RNaseH活性反應(yīng)的最適溫度禽酶42°C，二級結(jié)構(gòu)豐富RNA，禽酶效率高反應(yīng)的最適pH值禽酶pH8.3鼠酶pH7.61.3聚合酶兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別161.4DNA修飾酶堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基團(tuán)。polynucleotidekinase:來自于T4侵染的大腸桿菌，在5’端增加磷酸基團(tuán)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3‘端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。甲基化酶與限制性內(nèi)切酶具有相同的識別序列。1.4DNA修飾酶堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸171.4DNA修飾酶堿性磷酸酶（BAP,CIP）作用于載體的5’端，提高重組效率作用于外源DNA的5’端，防止自連1.4DNA修飾酶堿性磷酸酶（BAP,CIP）181.4DNA修飾酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）將γ-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’端放射性標(biāo)記DNA的5’端連接反應(yīng)中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接頭磷酸化1.4DNA修飾酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）191.4DNA修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TDT）3’端突出的雙鏈DNA，Mg2+平端或3‘凹端的低物，Co2+1.4DNA修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TDT）201.5拓?fù)洚悩?gòu)酶在共價(jià)閉合雙鏈上通過磷酸二酯鍵的短暫斷裂和重新連接解開超螺旋1.5拓?fù)洚悩?gòu)酶在共價(jià)閉合雙鏈上通過磷酸二酯鍵的短暫斷裂212限制性內(nèi)切酶2限制性內(nèi)切酶222限制性內(nèi)切酶RestrictionEndonuclease催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生限制性片段。不同來源的DNA具有不同的酶切位點(diǎn)以及不同的位點(diǎn)排列順序，因此各種生物的DNA均呈現(xiàn)特征性的限制性酶切圖譜。在生物分類、基因定位、疾病診斷、刑事診斷以及基因重組領(lǐng)域起重要作用，并譽(yù)為“分子手術(shù)刀”。2限制性內(nèi)切酶RestrictionEndonucle23限制-修飾現(xiàn)象限制-修飾現(xiàn)象242.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個(gè)類內(nèi)切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術(shù)的誕生奠定基礎(chǔ)。

2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象252.2限制性內(nèi)切酶分類

限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類：

I類II類*III類2.2限制性內(nèi)切酶分類限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類：26I類限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割,但是切割的核苷酸順序是隨機(jī)的。代表EcoB、EcoKI類限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一27(II型)限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個(gè)回文對稱順序(palindrome)，即有一個(gè)中心對稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。(II型)限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的28III型限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。III型限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,292.3限制性內(nèi)切酶的命名原則命名原則：取屬名的第一個(gè)字母大寫，取種名的前兩個(gè)字母小寫，構(gòu)成基本名稱。該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號I,II,III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個(gè)字母。若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。2.3限制性內(nèi)切酶的命名原則命名原則：取屬名的第一個(gè)字母30PvuI識別CGATCG，PvuII識別CAGCTG,都來自于Proteusvulgaris。HindIII是在Haemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上。PvuI識別CGATCG，PvuII識別CAGCTG,312.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物鈍端（平端）粘性末端2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物鈍端（平端）322.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同位酶（Isoschizomers）:識別序列相同但切點(diǎn)不同的酶。同尾酶：識別位點(diǎn)不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同位酶（Isoschizomers332.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物342.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同裂酶（同切酶或異源同工酶）：識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同，其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同裂酶（同切酶或異源同工酶）：識別352.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物星號活力（第二活性）PH離子強(qiáng)度甘油濃度過高≥10%時(shí)酶量2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物星號活力（第二活性）362.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目四堿基的酶平均大約每256個(gè)核苷酸（44）有一個(gè)識別位點(diǎn)，而六堿基的酶大約4096（46）個(gè)核苷酸有一個(gè)識別序列。λDNA長49kb，對于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn)。如BglII只有6個(gè)，BamHI只有5個(gè)，而SalI只有2個(gè)，意味著λDNA中GC含量少于50%。2.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目四堿基的酶平均大約每256372.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目識別堿基多為6，也有的4、5、8Sau3A來自于Staphylococcusaureus品系3A，識別GATC。有的酶識別兼并序列，如HinfI來自于Haemophilusinfluenzae品系Rf，識別GANTC，N代表A,G,T,C。2.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目識別堿基多為6，也有的4、38-基因工程操作技術(shù)課件392.6反應(yīng)程序體系：DNA分子（溶液） 酶 緩沖液（一般pH值7.4,含Mg2+,NaCl,還原劑如DDT穩(wěn)定酶阻止失活） 水2.6反應(yīng)程序體系：DNA分子（溶液）401U定義為在最佳緩沖系統(tǒng)和20ul體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μgDNA所需的酶量反應(yīng)條件一般為37°C，也有例外，如TaqI在65°C時(shí)活性最高。1U定義為在最佳緩沖系統(tǒng)和20ul體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解412.6反應(yīng)程序1）加入DNA2）加入Buffer3)加入酶4）37°C保溫1hr或過夜5)反應(yīng)終止，70°C加熱、加入EDTA、或加入苯酚2.6反應(yīng)程序1）加入DNA422.7酶切結(jié)果分析通過凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子。瓊脂糖凝膠電泳2.7酶切結(jié)果分析通過凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。43Standardelectrophoresis(a)doesnotseparateDNAfragmentsofdifferentsizes,whereasgelelectrophoresis(b)does-基因工程操作技術(shù)課件442.7酶切結(jié)果分析DNA分子的檢測EB染色，DNA分子小于25ng，很難檢測到放射性自顯影?？蓹z測2ngDNA。銀染2.7酶切結(jié)果分析DNA分子的檢測45放射性自顯影顯示DNA條帶放射性自顯影顯示DNA條帶462.8估計(jì)DNA分子的大小D=a-b(logM) D:移動距離，M:分子量，a,b是恒量。與已知大小的片段進(jìn)行比較，誤差約5%。2.8估計(jì)DNA分子的大小D=a-b(logM)47Figure4.16EstimationofthesizesofDNAfragmentsinanagarosegel.Figure4.1648Figure4.17UsingarestrictionmaptoworkoutwhichrestrictionendonucleasesshouldbeusedtoobtainDNAfragmentscontainingindividualgenes.Figure4.17492.9繪制DNA分子的酶切圖譜確定每一種酶切后產(chǎn)生片段的分子量和數(shù)目。進(jìn)行雙酶切。比較單酶切和雙酶切結(jié)果，繪制酶切圖譜。含糊的位點(diǎn)可以通過部分酶切解決。2.9繪制DNA分子的酶切圖譜確定每一種酶切后產(chǎn)生片段的50繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜51繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜52繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜532.10多酶聯(lián)合酶解

對離子強(qiáng)度要求相同的酶，可同時(shí)酶解。對離子強(qiáng)度要求不同的酶：低鹽濃度的酶先切，后補(bǔ)加NaCl一種酶切后，沉淀DNA，換緩沖液。2.10多酶聯(lián)合酶解

對離子強(qiáng)度要求相同的酶，可同54Figure4.19Ligation:thefinalstepinconstructionofarecombinantDNAmolecule.3連接Figure4.193連接55Figure4.20ThedifferentjoiningreactionscatalysedbyDNAlligase.Figure4.2056外源DNA與載體DNA的連接

相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接粘性末端的更換

外源DNA與載體DNA的連接相同粘性末端的連接573.1相同粘性末端的連接來源相同的酶同尾酶問題極性有兩種可能同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死”。3.1相同粘性末端的連接來源58同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'5'GAATTCCTTA59同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCAT5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'

TGATCAACTAGT5'

BamHI5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接退火GCCTAGGATCCG5'60不同酶的相同粘性末端的連接退火GCCTAGAATTCG5'

GCTTAA

5'

GATCCG5'GAATTCCTTAAG

GATCCG5'

5'

GCTTAA

5'EcoRIBamHIBamHI5'

5'GGATCCCCTAGG5'GCCTAGAATTCG5'

EcoRIT4-DNAligaseGCCTAGAATTCG5'

GCTTAA

5'

GATCCG不同酶的相同粘性末端的連接退火GCCTAGAATTCG5'613.2平頭末端的連接粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端--分子間的連接。

提高連接效率的方法：加大酶用量（10倍）加大平頭末端底物的濃度加入10%PEG（8000），促進(jìn)分子間的有效作用加入單價(jià)陽離子，150-200mMNaCl提高反應(yīng)溫度平頭連接同樣存在兩種極性3.2平頭末端的連接粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端-623.3不同粘性末端的連接突出5'末端Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接突出3'末端T4-DNApol切平，然后平頭連接突出末端不同Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。XbaI與HindIII（XbaI恢復(fù)），XbaI與EcoRI（均保留），BamHI與BglII（產(chǎn)生ClaI位點(diǎn)）3.3不同粘性末端的連接突出5'末端63不同粘性末端的連接T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'

CTGCAGGACGTC5'

BamHIPstI5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG不同粘性末端的連接T4-DNAligaseCGATCCGC643.4人工粘性末端的連接5'突出的末端外源片段先用Klenow補(bǔ)平；然后用TdT補(bǔ)加polyC；載體片段也用Klenow補(bǔ)平，加polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)遭受破壞。3'突出的末端外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補(bǔ)齊；連接

3.4人工粘性末端的連接5'突出的末端65平頭末端可直接用TdT補(bǔ)加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區(qū)就會出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段平頭末端66人工粘性末端的連接5‘突出末端5'Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGCCTAGGATCCG5'

BamHI5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGEcoRI退火T4-DNAligase5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGBamHIGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGBamHI人工粘性末端的連接5‘突出末端5'Klenow補(bǔ)平Kl67人工粘性末端的連接平頭末端TdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'CC3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAACC3'

GG5'

G3'C5'C3'GC3'

T4-DNAligase退火5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT人工粘性末端的連接平頭末端TdTTdTdTTPdATP68-基因工程操作技術(shù)課件693.5粘端與平端的連接linker:人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。連接的效率較高酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整。adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。3.5粘端與平端的連接linker:人工合成的、含有701.Linkers如何將平末端分子變?yōu)檎承阅┒朔肿?保護(hù)堿基1.Linkers如何將平末端分子變?yōu)檎承阅┒朔肿?保護(hù)71注意問題注意問題722.Adaptors2.Adaptors73Figure4.24

Thedistinctionbetweenthe5’-and3’-terminalofapolynucleotideFigure4.2474TheuseofadaptorsTheuseofadaptors753.6粘性末端的更換

在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口BamHI酶切片段用Klenow補(bǔ)平，或用S1酶切平；連接一段linker或Adaptor，使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端。這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口。由AluI更換EcoRI：AluI切開，T4-DNApol切平，另一段DNAEcoRI切開，Klenow補(bǔ)平，連接，原來含有AluI的片段變成含有EcoRI

3.6粘性末端的更換在DNA片段上某一酶切口處換成另一76粘性末端的更換5'

5'GGATCCCCTAGGBamHIGATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

Klenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIT4-DNAligaseGGAATTCCCCTTAAGGEcoRI

linker粘性末端的更換5'5'GGATCCCCTAGGBamHIG773.7重組率

重組率：含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比。較為理想的重組率為25-75%

提高重組率的方法：

連接反應(yīng)條件外源片段：載體＝2:1-10:1（分子數(shù)），增加碰撞機(jī)會，減少自身環(huán)化。載體除磷（磷酸酯酶5’除磷）。TdT在3’端增加人工粘性末端，防止載體自我環(huán)化。3.7重組率重組率：含有外源DNA片段的重組分子數(shù)與78脫磷酸化5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p退火5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A

G5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO脫磷酸化5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCT79本章重點(diǎn)核酸酶（DnaseI、S1核酸酶、RnaseH)連接酶修飾酶限制性內(nèi)切酶分類和命名原則同裂酶、星號活力等概念酶切產(chǎn)物種類及多酶切反應(yīng)方法提高連接效率和重組率的方法本章重點(diǎn)核酸酶（DnaseI、S1核酸酶、RnaseH801、有時(shí)候讀書是一種巧妙地避開思考的方法。12月-2212月-22Friday,December9,20222、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。17:39:3517:39:3517:3912/9/20225:39:35PM3、越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。12月-2217:39:3517:39Dec-2209-Dec-224、越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。17:39:3517:39:3517:39Friday,December9,20225、知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。12月-2212月-2217:39:3517:39:35December9,20226、意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。09十二月20225:39:35下午17:39:3512月-227、最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。。十二月225:39下午12月-2217:39December9,20228、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022/12/917:39:3517:39:3509December20229、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。5:39:35下午5:39下午17:39:3512月-2210、你要做多大的事情，就該承受多大的壓力。12/9/20225:39:35PM17:39:3509-12月-2211、自己要先看得起自己，別人才會看得起你。12/9/20225:39PM12/9/20225:39PM12月-2212月-2212、這一秒不放棄，下一秒就會有希望。09-Dec-2209December202212月-2213、無論才能知識多么卓著，如果缺乏熱情，則無異紙上畫餅充饑，無補(bǔ)于事。Friday,December9,202209-Dec-2212月-2214、我只是自己不放過自己而已，現(xiàn)在我不會再逼自己眷戀了。12月-2217:39:3509December202217:39謝謝大家1、有時(shí)候讀書是一種巧妙地避開思考的方法。12月-2212月81

Chapter4DNA操作技術(shù)Chapter4DNA操作技術(shù)82 DNA操作技術(shù)主要有：切割、連接、縮短、加長、轉(zhuǎn)錄成RNA，或者合成新的DNA，化學(xué)修飾、或者去掉特殊的化學(xué)基團(tuán)。

DNA操作技術(shù)主要有：切割、連接、縮短、加長、轉(zhuǎn)錄成RNA83學(xué)習(xí)內(nèi)容：DNA操作酶

核酸酶連接酶聚合酶DNA修飾酶限制性內(nèi)切酶分類和命名酶切體系、反應(yīng)條件、結(jié)果鑒定定位酶切位點(diǎn)連接學(xué)習(xí)內(nèi)容：DNA操作酶841.1核酸酶作用：降解磷酸二酯鍵分為：外切酶內(nèi)切酶1.DNA操作酶1.1核酸酶1.DNA操作酶851.1核酸酶Bal31(來自于細(xì)菌Alteromonasespejiana)單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，雙鏈特異的外切酶活性。依賴于Ca2+用途： 構(gòu)建限制酶圖譜 產(chǎn)生末端缺失突變 DNA超螺旋線性化1.1核酸酶Bal31(來自于細(xì)菌Alteromona861.1核酸酶來自于真菌Aspergillusoryzae的S1內(nèi)切酶作用于單鏈DNA或RNA。用途：

分析內(nèi)元的位置 獲得平端ds-DNA 酶量大時(shí)， 降解雙鏈DNA1.1核酸酶來自于真菌Aspergillusoryza871.1核酸酶來自于牛胰腺的DNaseI既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產(chǎn)生單核苷酸或短鏈。DNAFingerprintingwithDNaseI1.1核酸酶來自于牛胰腺的DNaseI既可以降解單鏈也881.1核酸酶RNaseH（E.coli）降解RNA:DNA雜交分子中的RNA。1.1核酸酶RNaseH（E.coli）891.2連接酶連接3‘端羥基和5’端磷酸形成磷酸二酯鍵。在DNA復(fù)制、修復(fù)、以及 體外重組 過程中起 重要作用。1.2連接酶連接3‘端羥基和5’端磷酸形成磷酸二酯鍵。在901.2連接酶T4-DNA連接酶連接粘性末端、平端修復(fù)雙鏈DNA或RNA-DNA雜交雙鏈上的缺口。E.coliDNA連接酶連接粘性末端（主要用于cDNA第二鏈的合成）1.2連接酶T4-DNA連接酶911.3聚合酶DNA聚合酶I5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性核酸內(nèi)切酶活性可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。1.3聚合酶DNA聚合酶I921.3聚合酶1.3聚合酶931.3聚合酶Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的粘端標(biāo)記DNA探針催化cDNA第二條鏈的合成末端終止法測序1.3聚合酶Klenow酶941.3聚合酶T4DNA聚合酶與Klenow酶相似，外切酶活性更高。體外誘變反應(yīng)中效率很高。T7DNA聚合酶測序酶TaqDNA聚合酶1.3聚合酶T4DNA聚合酶951.3聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney鼠白血病病毒）1.3聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA961.3聚合酶兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別肽鏈的組成禽酶2條肽鏈，具聚合酶和很強(qiáng)的RNaseH活性鼠酶1條，較弱的RNaseH活性反應(yīng)的最適溫度禽酶42°C，二級結(jié)構(gòu)豐富RNA，禽酶效率高反應(yīng)的最適pH值禽酶pH8.3鼠酶pH7.61.3聚合酶兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別971.4DNA修飾酶堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基團(tuán)。polynucleotidekinase:來自于T4侵染的大腸桿菌，在5’端增加磷酸基團(tuán)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3‘端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。甲基化酶與限制性內(nèi)切酶具有相同的識別序列。1.4DNA修飾酶堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸981.4DNA修飾酶堿性磷酸酶（BAP,CIP）作用于載體的5’端，提高重組效率作用于外源DNA的5’端，防止自連1.4DNA修飾酶堿性磷酸酶（BAP,CIP）991.4DNA修飾酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）將γ-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’端放射性標(biāo)記DNA的5’端連接反應(yīng)中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接頭磷酸化1.4DNA修飾酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）1001.4DNA修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TDT）3’端突出的雙鏈DNA，Mg2+平端或3‘凹端的低物，Co2+1.4DNA修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TDT）1011.5拓?fù)洚悩?gòu)酶在共價(jià)閉合雙鏈上通過磷酸二酯鍵的短暫斷裂和重新連接解開超螺旋1.5拓?fù)洚悩?gòu)酶在共價(jià)閉合雙鏈上通過磷酸二酯鍵的短暫斷裂1022限制性內(nèi)切酶2限制性內(nèi)切酶1032限制性內(nèi)切酶RestrictionEndonuclease催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生限制性片段。不同來源的DNA具有不同的酶切位點(diǎn)以及不同的位點(diǎn)排列順序，因此各種生物的DNA均呈現(xiàn)特征性的限制性酶切圖譜。在生物分類、基因定位、疾病診斷、刑事診斷以及基因重組領(lǐng)域起重要作用，并譽(yù)為“分子手術(shù)刀”。2限制性內(nèi)切酶RestrictionEndonucle104限制-修飾現(xiàn)象限制-修飾現(xiàn)象1052.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個(gè)類內(nèi)切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術(shù)的誕生奠定基礎(chǔ)。

2.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象1062.2限制性內(nèi)切酶分類

限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類：

I類II類*III類2.2限制性內(nèi)切酶分類限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類：107I類限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割,但是切割的核苷酸順序是隨機(jī)的。代表EcoB、EcoKI類限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一108(II型)限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個(gè)回文對稱順序(palindrome)，即有一個(gè)中心對稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。(II型)限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的109III型限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。III型限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,1102.3限制性內(nèi)切酶的命名原則命名原則：取屬名的第一個(gè)字母大寫，取種名的前兩個(gè)字母小寫，構(gòu)成基本名稱。該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號I,II,III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個(gè)字母。若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。2.3限制性內(nèi)切酶的命名原則命名原則：取屬名的第一個(gè)字母111PvuI識別CGATCG，PvuII識別CAGCTG,都來自于Proteusvulgaris。HindIII是在Haemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上。PvuI識別CGATCG，PvuII識別CAGCTG,1122.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物鈍端（平端）粘性末端2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物鈍端（平端）1132.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同位酶（Isoschizomers）:識別序列相同但切點(diǎn)不同的酶。同尾酶：識別位點(diǎn)不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同位酶（Isoschizomers1142.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物1152.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同裂酶（同切酶或異源同工酶）：識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同，其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。HpaⅡ和MspⅠ的識別順序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物同裂酶（同切酶或異源同工酶）：識別1162.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物星號活力（第二活性）PH離子強(qiáng)度甘油濃度過高≥10%時(shí)酶量2.4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物星號活力（第二活性）1172.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目四堿基的酶平均大約每256個(gè)核苷酸（44）有一個(gè)識別位點(diǎn)，而六堿基的酶大約4096（46）個(gè)核苷酸有一個(gè)識別序列。λDNA長49kb，對于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn)。如BglII只有6個(gè)，BamHI只有5個(gè)，而SalI只有2個(gè)，意味著λDNA中GC含量少于50%。2.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目四堿基的酶平均大約每2561182.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目識別堿基多為6，也有的4、5、8Sau3A來自于Staphylococcusaureus品系3A，識別GATC。有的酶識別兼并序列，如HinfI來自于Haemophilusinfluenzae品系Rf，識別GANTC，N代表A,G,T,C。2.5DNA分子中識別位點(diǎn)的數(shù)目識別堿基多為6，也有的4、119-基因工程操作技術(shù)課件1202.6反應(yīng)程序體系：DNA分子（溶液） 酶 緩沖液（一般pH值7.4,含Mg2+,NaCl,還原劑如DDT穩(wěn)定酶阻止失活） 水2.6反應(yīng)程序體系：DNA分子（溶液）1211U定義為在最佳緩沖系統(tǒng)和20ul體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μgDNA所需的酶量反應(yīng)條件一般為37°C，也有例外，如TaqI在65°C時(shí)活性最高。1U定義為在最佳緩沖系統(tǒng)和20ul體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1222.6反應(yīng)程序1）加入DNA2）加入Buffer3)加入酶4）37°C保溫1hr或過夜5)反應(yīng)終止，70°C加熱、加入EDTA、或加入苯酚2.6反應(yīng)程序1）加入DNA1232.7酶切結(jié)果分析通過凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子。瓊脂糖凝膠電泳2.7酶切結(jié)果分析通過凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。124Standardelectrophoresis(a)doesnotseparateDNAfragmentsofdifferentsizes,whereasgelelectrophoresis(b)does-基因工程操作技術(shù)課件1252.7酶切結(jié)果分析DNA分子的檢測EB染色，DNA分子小于25ng，很難檢測到放射性自顯影?？蓹z測2ngDNA。銀染2.7酶切結(jié)果分析DNA分子的檢測126放射性自顯影顯示DNA條帶放射性自顯影顯示DNA條帶1272.8估計(jì)DNA分子的大小D=a-b(logM) D:移動距離，M:分子量，a,b是恒量。與已知大小的片段進(jìn)行比較，誤差約5%。2.8估計(jì)DNA分子的大小D=a-b(logM)128Figure4.16EstimationofthesizesofDNAfragmentsinanagarosegel.Figure4.16129Figure4.17UsingarestrictionmaptoworkoutwhichrestrictionendonucleasesshouldbeusedtoobtainDNAfragmentscontainingindividualgenes.Figure4.171302.9繪制DNA分子的酶切圖譜確定每一種酶切后產(chǎn)生片段的分子量和數(shù)目。進(jìn)行雙酶切。比較單酶切和雙酶切結(jié)果，繪制酶切圖譜。含糊的位點(diǎn)可以通過部分酶切解決。2.9繪制DNA分子的酶切圖譜確定每一種酶切后產(chǎn)生片段的131繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜132繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜133繪制酶切圖譜繪制酶切圖譜1342.10多酶聯(lián)合酶解

對離子強(qiáng)度要求相同的酶，可同時(shí)酶解。對離子強(qiáng)度要求不同的酶：低鹽濃度的酶先切，后補(bǔ)加NaCl一種酶切后，沉淀DNA，換緩沖液。2.10多酶聯(lián)合酶解

對離子強(qiáng)度要求相同的酶，可同135Figure4.19Ligation:thefinalstepinconstructionofarecombinantDNAmolecule.3連接Figure4.193連接136Figure4.20ThedifferentjoiningreactionscatalysedbyDNAlligase.Figure4.20137外源DNA與載體DNA的連接

相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接粘性末端的更換

外源DNA與載體DNA的連接相同粘性末端的連接1383.1相同粘性末端的連接來源相同的酶同尾酶問題極性有兩種可能同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死”。3.1相同粘性末端的連接來源139同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'5'GAATTCCTTA140同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCAT5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'

TGATCAACTAGT5'

BamHI5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接退火GCCTAGGATCCG5'141不同酶的相同粘性末端的連接退火GCCTAGAATTCG5'

GCTTAA

5'

GATCCG5'GAATTCCTTAAG

GATCCG5'

5'

GCTTAA

5'EcoRIBamHIBamHI5'

5'GGATCCCCTAGG5'GCCTAGAATTCG5'

EcoRIT4-DNAligaseGCCTAGAATTCG5'

GCTTAA

5'

GATCCG不同酶的相同粘性末端的連接退火GCCTAGAATTCG5'1423.2平頭末端的連接粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端--分子間的連接。

提高連接效率的方法：加大酶用量（10倍）加大平頭末端底物的濃度加入10%PEG（8000），促進(jìn)分子間的有效作用加入單價(jià)陽離子，150-200mMNaCl提高反應(yīng)溫度平頭連接同樣存在兩種極性3.2平頭末端的連接粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端-1433.3不同粘性末端的連接突出5'末端Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接突出3'末端T4-DNApol切平，然后平頭連接突出末端不同Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。XbaI與HindIII（XbaI恢復(fù)），XbaI與EcoRI（均保留），BamHI與BglII（產(chǎn)生ClaI位點(diǎn)）3.3不同粘性末端的連接突出5'末端144不同粘性末端的連接T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'

CTGCAGGACGTC5'

BamHIPstI5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG不同粘性末端的連接T4-DNAligaseCGATCCGC1453.4人工粘性末端的連接5'突出的末端外源片段先用Klenow補(bǔ)平；然后用TdT補(bǔ)加polyC；載體片段也用Klenow補(bǔ)平，加polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)遭受破壞。3'突出的末端外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補(bǔ)齊；連接

3.4人工粘性末端的連接5'突出的末端146平頭末端可直接用TdT補(bǔ)加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區(qū)就會出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段平頭末端147人工粘性末端的連接5‘突出末端5'Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGCCTAGGATCCG5'

BamHI5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGEcoRI退火T4-DNAligase5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGBamHIGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGBamHI人工粘性末端的連接5‘突出末端5'Klenow補(bǔ)平Kl148人工粘性末端的連接平頭末端TdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'CC3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAACC3'

GG5'

G3'C5'C3'GC3'

T4-DNAligase退火5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT人工粘性末端的連接平頭末端TdTTdTdTTPdATP149-基因工程操作技術(shù)課件1503.5粘端與平端的連接linker:人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。連接的效率較高酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整。adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。3.5粘端與平端的連接linker:人工合成的、含有1511.Linkers如何將平末端分子變?yōu)檎承阅┒朔肿?保護(hù)堿基1.Linkers如何將平末端分子變?yōu)檎承阅┒朔肿?保護(hù)152注意問