DNA生物合成課件講義

§核酸的生物合成青島農業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室§核酸的生物合成青島農業(yè)大學生命科學學院1復制的方式——半保留復制(semi-conservativereplication)復制的高保真性(highfidelity)雙向復制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)復制的方式2一.DNA的半保留復制復制時,每一條DNA鏈在新鏈合成中充當模板，按堿基配對方式形成兩個新的DNA分子，每個分子都含有一條新鏈和一條舊鏈，這種復制方式即半保留復制(semiconservativereplication)。Watson和Crick開創(chuàng)性的論文，對DNA雙螺旋的描述以這樣一段陳述結尾：“不出我們的意料，我們所假設的特異性配對立即提示一種遺傳物質可能的復制機制?！?/p>

一.DNA的半保留復制復制時,每一條DNA3半保留復制親代第一代第二代半保留復制的實驗證據(jù)

1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復制。半保留復制親代第一代第二代半保留復制的實驗證據(jù)4重輕雜和DNA雜和DNA重輕雜和DNA雜和DNA5新鏈舊鏈DNA的半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。（但DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質。）新鏈舊鏈DNA的半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表6二.復制的起點和方向

復制是一個高度協(xié)調的過程，母鏈解鏈和復制同時進行。（一）概念●復制子(replicon)：基因組能獨立進行復制的單位。●起點(origin)：控制復制起始，是含有100～200個堿基對的一段DNA。細胞內存在著能識別起點的特殊蛋白質(大腸桿菌中稱為DnaA蛋白)。二.復制的起點和方向復制是一個高度協(xié)調的過7●終點(terminus)：終止復制的序列位點.●復制叉(replicationfork)：復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結構?！窠K點(terminus)：終止復制的序列位點.8DNA生物合成課件講義9原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。復制中的放射自顯影圖象原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈10A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點oriterA11真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功能單位。真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。125’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’13原核生物：只有一個復制子真核生物：多個復制子，多個起點，形成多個“復制眼”或“復制泡”原核生物：只有一個復制子14（二）起始點和方向1.原核生物和真核生物復制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大腸桿菌起始點有固定的保守順序GATC和TTATCCACA，多次出現(xiàn)，可被酶識別。2.方向：大多是雙向、對稱復制,也有單向或不對稱的。3.速度：原核生物復制叉移動快(約105bp/min);真核生物復制叉移動慢(約5×102～5×103bp/min)（二）起始點和方向2.方向：大多是雙向、對稱復15雙向復制復制叉起點起點單向復制雙向復制復制叉起點起點單向復制16復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）17三.原核細胞DNA的復制(DNA指導下的DNA合成)（一）DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA-pol)DNA聚合酶是一種催化依賴模板的由脫氧核苷三磷酸前體合成DNA的酶。1956年Arthurkornberg等首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后在廣泛不同的生物中都找到有這種酶。三.原核細胞DNA的復制(DNA指導下的DNA合成)（一）18DNA聚合酶的反應特點：?

4種dNTP底物：(dATPdGTPdCTPdTTP)；?接受模板指導:解開成單鏈的DNA母鏈；?需引物提供3′-OH；?新鏈生長方向：5′→3′；?產物DNA性質與模板相同。DNA聚合酶的反應特點：19

此外,DNA復制過程中還需其它酶和蛋白質因子.模板DNA鏈引物新加入的dNTP脫氧核糖親核攻擊5′3′生長的DNA鏈*引物(primer)是一和模板鏈互補的線性片段,其上帶有能與核苷酸相結合的游離3′-OH.引物通常是寡聚RNA.此外,DNA復制過程中還需其它酶和蛋白質因子.模板20ArthurKornbergWonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid

(beforeWatsonandCrickwontheirs!)ArthurKornberg21（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol

ⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ22功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅠ（109kD）功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填23323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Kl24DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)25功能是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)功能DNA-polⅢ26DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ亞基數(shù)目1≥7≥105′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+-

-聚合速度(核苷酸/分)1000-1200240015000-60000

持續(xù)合成能力3-2001500≥500000功能切除引物,修復修復復制表大腸桿菌3種DNA聚合酶性質比較DNA聚合酶27（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引28DNA生物合成課件講義29四、復制中的分子解鏈及DNA分子拓撲學變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

四、復制中的分子解鏈及DNA分子拓撲學變化DNA分子的堿30（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白31解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

解螺旋酶(helicase)32108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)

108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶(DNAtop33拓撲異構酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ分類拓撲異構酶作用特點拓撲異構酶Ⅰ分類34拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結35五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈536HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’37DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。功能381、岡崎片段和半不連續(xù)復制（1）岡崎片段(Okazakifragment)：

在不連續(xù)的后隨鏈DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有1000～2000核苷酸，真核生物約100～200核苷酸。1968年岡崎發(fā)現(xiàn)。（二）雙鏈DNA復制的分子機制1、岡崎片段和半不連續(xù)復制（二）雙鏈DNA復制的分子機制39（2）DNA的半不連續(xù)復制(semidiscontinuousreplication)：DNA雙鏈復制時，一條鏈是連續(xù)合成的(前導鏈,leadingstrand),另一條鏈是不連續(xù)合成的(滯后鏈或后隨鏈,laggingstrand),這種前導鏈的連續(xù)復制和后隨鏈的不連續(xù)復制方式稱DNA的半不連續(xù)復制。（2）DNA的半不連續(xù)復制(semidiscontinuou40DNA生物合成課件講義4135353′5′3′5′解鏈方向領頭鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復制3′5′35353′5′3′5′解鏈方向領頭鏈后隨鏈DNA的42復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’432、DNA半不連續(xù)復制中的RNA引物（1）前導鏈和滯后鏈的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(DnaG)：是以DNA為模板的RNA聚合酶（合成方向5′→3′）,合成的引物長度為5～10nt。(3)引物RNA的起始和終止的位置受解鏈酶、引發(fā)酶、模板順序及其二級結構的影響。（4）DNA聚合酶Ⅰ切除前導鏈及岡崎片段的引物后,填補空缺，由DNA連接酶將切口連接。2、DNA半不連續(xù)復制中的RNA引物44總結:

原核生物DNA的復制過程:(以大腸桿菌為例)●雙鏈的解開●起始----RNA引物的合成●DNA鏈的延伸●終止總結:45B.RNA引物的合成引發(fā)體先與DNA起始部位雙鏈結合，通過引物合成酶形成前導鏈引物后，再沿5′→3′模板鏈與復制叉同向移動，在移動中斷斷續(xù)續(xù)形成岡崎片段的RNA引物。A.雙鏈的解開DNA旋轉酶(拓撲異構酶Π)、DNA解鏈酶、單鏈結合蛋白協(xié)同作用B.RNA引物的合成A.雙鏈的解開46C.DNA鏈的延伸

在DNApolШ的催化下，以四種dNTP為底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行領頭鏈和后隨鏈的合成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polC.DNA鏈的延伸5'3'5'dATPdGTPd47①前導鏈的延長：DNApolⅢ全酶二聚體的一個亞基與前導鏈的模板結合而發(fā)揮催化作用，與復制叉同向。①前導鏈的延長：48②滯后鏈的延長:DNA

pol

Ⅲ全酶二聚體的另一亞基與形成一個環(huán)的滯后鏈的模板結合發(fā)揮催化作用。

由于模板形成環(huán),酶向前移動時,滯后鏈合成片段也沿5′→3′方向生長,與酶催化方向一致。滯后鏈片段合成接近前方滯后鏈片段5′末端時,模板被釋放,環(huán)消失。繼續(xù)重復,連續(xù)進行。②滯后鏈的延長:49DNA生物合成課件講義50?當新形成的岡崎片段延長至一定長度,其3′-OH遇到上一個岡崎片段時即停止合成。?一旦岡崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通過DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之，并形成一個切口，此切口由DNA連接酶連接封閉。?當新形成的岡崎片段延長至一定長度,其351D.復制終止

細菌環(huán)狀染色體的兩個復制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復制，復制體解體。

這樣,以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補鏈，結果形成了兩個DNA雙股螺旋分子。

就目前所知，起始階段是DNA復制中唯一一個可以受調節(jié)的階段，由于受到調節(jié)而使得DNA在一個細胞周期中只發(fā)生一次復制。D.復制終止就目前所知，起始階段是DN52DNA生物合成課件講義53復制的保真性(fidelity)主要依賴3種機制：聚合酶對堿基的選擇；

3′→5′方向的外切核酸酶活性起校正作用;復制后錯配現(xiàn)象的特異性修復機制。5.DNA聚合酶的“校對”(proofreading)作用

大腸桿菌DNA復制錯配率約10-9~10-10。其染色體中有4.5×106bp，平均每1000～10000個細胞經過一次分裂才會插入一個不正確的堿基。復制的保真性(fidelity)主要依賴3種機制54DNA生物合成課件講義55小結－維持DNA復制準確性的因素：內因:①按堿基配對原則(錯配率10-4~10-5)②DNA聚合酶的作用(錯配率10-4~10-5)

?對堿基的識別作用----選擇正確的堿基參入到引物末端

?對底物的識別作用----先識別引物最后一個堿基是否正確,后識別參入的dNTP是否正確

?校正閱讀----3′→5′外切酶的作用③RNA引物最終被切除,提高了復制準確性④復制完成后對錯配堿基進行修復的酶系統(tǒng)外因：?四種dNTP要平衡；?Mn2+和Mg2+的比例、濃度（酶活）小結－維持DNA復制準確性的因素：56(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5種---

αβγδεDNA-polα－－現(xiàn)認為其功能只是合成引物DNA-pol

δ－－在復制延長中起催化作用DNA-polε－－校對、修復、填補(類似E.coliDNApolI)DNA-polγ－－線粒體DNA合成DNA-polβ－－核DNA修復

四、真核細胞DNA的復制－－（DNA指導下的DNA合成）推測在復制叉上有一個DNApolα,以合成引物;兩個DNApolδ,分別合成前導鏈和滯后鏈。(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5種---αβγδεD57（二）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp.3、真核生物DNA復制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。5、真核生物有多種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結構，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5端RNA引物切除后的填補，亦保持端粒的一定長度。（二）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制58端粒端粒中心粒圖真核生物染色體端粒(telomere)是真核生物線性染色體的兩個末端所具有的特殊結構,其共同特點是一條鏈上富含T、G短序列的多次重復,而其互補鏈上富含A、C。（三）端粒的復制端粒端粒中心粒圖真核生物染色體端粒59端粒主要有兩大生理功能：（1）維持染色體結構的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融和。（2）防止染色體結構基因在復制時丟失，解決了末端復制的難題。端粒的合成主要依靠端粒酶來催化。端粒主要有兩大生理功能：（1）維持染色體結構的完60線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。53355335端粒酶是一種RNA-蛋白質復合體,它可以其RNA為模板,通過逆轉錄過程對末端DNA鏈進行延長。線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA61DNA生物合成課件講義62端粒酶的爬行模型（動畫演示）端粒酶的爬行模型（動畫演示）63五、反轉錄作用（RNA指導的DNA合成）定義:以RNA為模板,按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程稱為反轉錄(reversetranscription,RT)。該過程由反轉錄酶催化進行。1970年Temin和Baltimore同時分別從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出反轉錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反轉錄酶。五、反轉錄作用（RNA指導的DNA合成）定義:以RNA為模64+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反轉錄過程

（以前病毒形式整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

反轉錄酶反轉錄酶

逆轉錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導的DNA聚合酶活性DNA指導的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5'

3'和3'

5'兩個方向起核酸外切酶的作用。反轉錄酶也和DNA聚合酶一樣,沿5′3′方向合成DNA,并要求短鏈RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反轉錄65六、DNA的損傷修復?DNA的損傷：DNA在復制時產生錯配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，破壞DNA的雙螺旋結構，從而影響DNA的復制，并使DNA的轉錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。?若DNA的損傷或錯配得不到修復，會導致DNA突變。其主要形式：一個或幾個堿基被置換插入一個或幾個堿基一個或多個堿基對缺失?DNA的損傷修復——

5種修復途徑:錯配修復、光復活修復、切除修復、重組修復和誘導修復（亦稱暗修復）。六、DNA的損傷修復66錯配修復：修復DNA中堿基錯配的酶系統(tǒng)。其過程是：識別出不正確的鏈，切除掉不正確鏈的部分，然后通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA。光復活修復：400nm左右的光激活光復活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上的TT（或CC，CT）二聚體。（包括從單細胞生物到鳥類，而高等哺乳動物無）切除修復：將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（發(fā)生在DNA復制前）錯配修復：修復DNA中堿基錯配的酶系統(tǒng)。其過程是：識別出不正67重組修復（發(fā)生在復制后）：復制時，跳過損傷部位，新鏈產生的缺口由母鏈彌補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸稀釋。誘導修復：造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應,稱為應急反應(SOSresponse)。此過程誘導產生切除修復和重組修復中的關鍵蛋白和酶，同時產生無校對功能的DNA聚合酶。所以會有2種結果：修復或變異（進化）。重組修復（發(fā)生在復制后）：復制時，跳過損傷部位，新鏈產生的缺68相鄰的胸腺嘧啶紫外線照射環(huán)丁烷胸腺嘧啶二聚體紫外線誘導嘧啶二聚體形成相鄰的胸腺嘧啶紫外線照射環(huán)丁烷胸腺嘧啶二聚體紫外線誘導嘧啶二69DNA生物合成課件講義70DNA生物合成課件講義71DNA生物合成課件講義72螢火蟲的熒光素基因在煙草中表達人生長素基因被導入并整合到右邊小鼠的基因組番茄工程植株具有抗昆蟲幼蟲的能力螢火蟲的熒光素基因人生長素基因被導入并整合到右邊小鼠73§核酸的生物合成青島農業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室§核酸的生物合成青島農業(yè)大學生命科學學院74復制的方式——半保留復制(semi-conservativereplication)復制的高保真性(highfidelity)雙向復制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)復制的方式75一.DNA的半保留復制復制時,每一條DNA鏈在新鏈合成中充當模板，按堿基配對方式形成兩個新的DNA分子，每個分子都含有一條新鏈和一條舊鏈，這種復制方式即半保留復制(semiconservativereplication)。Watson和Crick開創(chuàng)性的論文，對DNA雙螺旋的描述以這樣一段陳述結尾：“不出我們的意料，我們所假設的特異性配對立即提示一種遺傳物質可能的復制機制。”

一.DNA的半保留復制復制時,每一條DNA76半保留復制親代第一代第二代半保留復制的實驗證據(jù)

1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復制。半保留復制親代第一代第二代半保留復制的實驗證據(jù)77重輕雜和DNA雜和DNA重輕雜和DNA雜和DNA78新鏈舊鏈DNA的半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。（但DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質。）新鏈舊鏈DNA的半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表79二.復制的起點和方向

復制是一個高度協(xié)調的過程，母鏈解鏈和復制同時進行。（一）概念●復制子(replicon)：基因組能獨立進行復制的單位?！衿瘘c(origin)：控制復制起始，是含有100～200個堿基對的一段DNA。細胞內存在著能識別起點的特殊蛋白質(大腸桿菌中稱為DnaA蛋白)。二.復制的起點和方向復制是一個高度協(xié)調的過80●終點(terminus)：終止復制的序列位點.●復制叉(replicationfork)：復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結構?！窠K點(terminus)：終止復制的序列位點.81DNA生物合成課件講義82原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。復制中的放射自顯影圖象原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈83A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點oriterA84真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功能單位。真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。855’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’86原核生物：只有一個復制子真核生物：多個復制子，多個起點，形成多個“復制眼”或“復制泡”原核生物：只有一個復制子87（二）起始點和方向1.原核生物和真核生物復制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大腸桿菌起始點有固定的保守順序GATC和TTATCCACA，多次出現(xiàn)，可被酶識別。2.方向：大多是雙向、對稱復制,也有單向或不對稱的。3.速度：原核生物復制叉移動快(約105bp/min);真核生物復制叉移動慢(約5×102～5×103bp/min)（二）起始點和方向2.方向：大多是雙向、對稱復88雙向復制復制叉起點起點單向復制雙向復制復制叉起點起點單向復制89復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）90三.原核細胞DNA的復制(DNA指導下的DNA合成)（一）DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA-pol)DNA聚合酶是一種催化依賴模板的由脫氧核苷三磷酸前體合成DNA的酶。1956年Arthurkornberg等首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后在廣泛不同的生物中都找到有這種酶。三.原核細胞DNA的復制(DNA指導下的DNA合成)（一）91DNA聚合酶的反應特點：?

4種dNTP底物：(dATPdGTPdCTPdTTP)；?接受模板指導:解開成單鏈的DNA母鏈；?需引物提供3′-OH；?新鏈生長方向：5′→3′；?產物DNA性質與模板相同。DNA聚合酶的反應特點：92

此外,DNA復制過程中還需其它酶和蛋白質因子.模板DNA鏈引物新加入的dNTP脫氧核糖親核攻擊5′3′生長的DNA鏈*引物(primer)是一和模板鏈互補的線性片段,其上帶有能與核苷酸相結合的游離3′-OH.引物通常是寡聚RNA.此外,DNA復制過程中還需其它酶和蛋白質因子.模板93ArthurKornbergWonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid

(beforeWatsonandCrickwontheirs!)ArthurKornberg94（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol

ⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ95功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-polⅠ（109kD）功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填96323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Kl97DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)98功能是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)功能DNA-polⅢ99DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ亞基數(shù)目1≥7≥105′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+-

-聚合速度(核苷酸/分)1000-1200240015000-60000

持續(xù)合成能力3-2001500≥500000功能切除引物,修復修復復制表大腸桿菌3種DNA聚合酶性質比較DNA聚合酶100（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引101DNA生物合成課件講義102四、復制中的分子解鏈及DNA分子拓撲學變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

四、復制中的分子解鏈及DNA分子拓撲學變化DNA分子的堿103（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白104解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

解螺旋酶(helicase)105108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)

108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶(DNAtop106拓撲異構酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ分類拓撲異構酶作用特點拓撲異構酶Ⅰ分類107拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結108五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5109HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’110DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。功能1111、岡崎片段和半不連續(xù)復制（1）岡崎片段(Okazakifragment)：

在不連續(xù)的后隨鏈DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有1000～2000核苷酸，真核生物約100～200核苷酸。1968年岡崎發(fā)現(xiàn)。（二）雙鏈DNA復制的分子機制1、岡崎片段和半不連續(xù)復制（二）雙鏈DNA復制的分子機制112（2）DNA的半不連續(xù)復制(semidiscontinuousreplication)：DNA雙鏈復制時，一條鏈是連續(xù)合成的(前導鏈,leadingstrand),另一條鏈是不連續(xù)合成的(滯后鏈或后隨鏈,laggingstrand),這種前導鏈的連續(xù)復制和后隨鏈的不連續(xù)復制方式稱DNA的半不連續(xù)復制。（2）DNA的半不連續(xù)復制(semidiscontinuou113DNA生物合成課件講義11435353′5′3′5′解鏈方向領頭鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復制3′5′35353′5′3′5′解鏈方向領頭鏈后隨鏈DNA的115復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’1162、DNA半不連續(xù)復制中的RNA引物（1）前導鏈和滯后鏈的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(DnaG)：是以DNA為模板的RNA聚合酶（合成方向5′→3′）,合成的引物長度為5～10nt。(3)引物RNA的起始和終止的位置受解鏈酶、引發(fā)酶、模板順序及其二級結構的影響。（4）DNA聚合酶Ⅰ切除前導鏈及岡崎片段的引物后,填補空缺，由DNA連接酶將切口連接。2、DNA半不連續(xù)復制中的RNA引物117總結:

原核生物DNA的復制過程:(以大腸桿菌為例)●雙鏈的解開●起始----RNA引物的合成●DNA鏈的延伸●終止總結:118B.RNA引物的合成引發(fā)體先與DNA起始部位雙鏈結合，通過引物合成酶形成前導鏈引物后，再沿5′→3′模板鏈與復制叉同向移動，在移動中斷斷續(xù)續(xù)形成岡崎片段的RNA引物。A.雙鏈的解開DNA旋轉酶(拓撲異構酶Π)、DNA解鏈酶、單鏈結合蛋白協(xié)同作用B.RNA引物的合成A.雙鏈的解開119C.DNA鏈的延伸

在DNApolШ的催化下，以四種dNTP為底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行領頭鏈和后隨鏈的合成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polC.DNA鏈的延伸5'3'5'dATPdGTPd120①前導鏈的延長：DNApolⅢ全酶二聚體的一個亞基與前導鏈的模板結合而發(fā)揮催化作用，與復制叉同向。①前導鏈的延長：121②滯后鏈的延長:DNA

pol

Ⅲ全酶二聚體的另一亞基與形成一個環(huán)的滯后鏈的模板結合發(fā)揮催化作用。

由于模板形成環(huán),酶向前移動時,滯后鏈合成片段也沿5′→3′方向生長,與酶催化方向一致。滯后鏈片段合成接近前方滯后鏈片段5′末端時,模板被釋放,環(huán)消失。繼續(xù)重復,連續(xù)進行。②滯后鏈的延長:122DNA生物合成課件講義123?當新形成的岡崎片段延長至一定長度,其3′-OH遇到上一個岡崎片段時即停止合成。?一旦岡崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通過DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之，并形成一個切口，此切口由DNA連接酶連接封閉。?當新形成的岡崎片段延長至一定長度,其3124D.復制終止

細菌環(huán)狀染色體的兩個復制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復制，復制體解體。

這樣,以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補鏈，結果形成了兩個DNA雙股螺旋分子。

就目前所知，起始階段是DNA復制中唯一一個可以受調節(jié)的階段，由于受到調節(jié)而使得DNA在一個細胞周期中只發(fā)生一次復制。D.復制終止就目前所知，起始階段是DN125DNA生物合成課件講義126復制的保真性(fidelity)主要依賴3種機制：聚合酶對堿基的選擇；

3′→5′方向的外切核酸酶活性起校正作用;復制后錯配現(xiàn)象的特異性修復機制。5.DNA聚合酶的“校對”(proofreading)作用

大腸桿菌DNA復制錯配率約10-9~10-10。其染色體中有4.5×106bp，平均每1000～10000個細胞經過一次分裂才會插入一個不正確的堿基。復制的保真性(fidelity)主要依賴3種機制127DNA生物合成課件講義128小結－維持DNA復制準確性的因素：內因:①按堿基配對原則(錯配率10-4~10-5)②DNA聚合酶的作用(錯配率10-4~10-5)

?對堿基的識別作用----選擇正確的堿基參入到引物末端

?對底物的識別作用----先識別引物最后一個堿基是否正確,后識別參入的dNTP是否正確

?校正閱讀----3′→5′外切酶的作用③RNA引物最終被切除,提高了復制準確性④復制完成后對錯配堿基進行修復的酶系統(tǒng)外因：?四種dNTP要平衡；?Mn2+和Mg2+的比例、濃度（酶活）小結－維持DNA復制準確性的因素：129(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5種---

αβγδεDNA-polα－－現(xiàn)認為其功能只是合成引物DNA-pol

δ－－在復制延長中起催化作用DNA-polε－－校對、修復、填補(類似E.coliDNApolI)DNA-polγ－－線粒體DNA合成DNA-polβ－－核DNA修復

四、真核細胞DNA的復制－－（DNA指導下的DNA合成）推測在復制叉上有一個DNApolα,以合成引物;兩個DNApolδ,分別合成前導鏈和滯后鏈。(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5種---αβγδεD130（二）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp.3、真核生物DNA復制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。5、真核生物有多種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結構，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5端RNA引物切除后的填補，亦保持端粒的一定長度。（二）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制131端粒端粒