手足口病的實驗診斷

手足口病的實驗診斷手足口病的病原手足口病〔,〕由人腸道病毒感染引起。人腸道病毒為小病毒科〔〕，腸道病毒屬〔〕的一組單股正鏈病毒。其中包括埃可病毒〔31個血清型〕、柯薩奇病毒A組〔23個血清型〕和B組〔5個血清型〕，還包括3個脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型和人腸道病毒68-71型。M.,,~30二十面體對稱無包膜人腸道病毒的毒粒構(gòu)造人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了根底?？滤_奇病毒：1948年在美國紐約鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標(biāo)本接種至乳鼠體內(nèi)，別離出來的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們在乳鼠上產(chǎn)生的組織病理學(xué)變化和在細胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。?？刹《荆?951年在一名無病癥的兒童的糞便標(biāo)本中別離到，在細胞培養(yǎng)上可以造成致細胞病變，但對乳鼠和靈長類動物不致病。新腸道病毒：隨后新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號命名〔69~71〕，最近，已經(jīng)命名至102型腸道病毒主要血清型手足口病的常見致病病原多種腸道病毒都可引起，主要為：柯薩奇病毒A組的4～7、9、10、16型B組的1～3、5型?？刹《镜木植垦逍湍c道病毒71型最常見的為16和71腸道病毒的抵抗力腸道病毒無包膜，乙醚、75%酒精、外表活性劑等均不能將其滅活。對紫外線及枯燥敏感；各種氧化劑〔高錳酸鉀、漂白粉等〕、甲醛或56℃30都能滅活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保持感染性病毒有感染性?！惨弧臣S便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5～8份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱?！捕衬X脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進展病原和抗體檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥后3日內(nèi)，采集量為1.0～2.0。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集手足口病的標(biāo)本采集〔三〕血清標(biāo)本采集急性期(發(fā)病0～5天)和恢復(fù)期(發(fā)病14～30天)雙份配對血清用于抗體檢測。檢測時，采集(發(fā)病7～20天)血。靜脈采集3～5全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，別離血清，將血清置于－20℃以下冰箱中冷凍保存?！菜摹逞适米訕?biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)防止觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5保存液〔細胞維持液〕的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱?！参濉嘲捳钜嚎赏瑫r采集多個皰疹作為一份標(biāo)本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5保存液〔維持液或生理鹽水〕的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4℃暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集標(biāo)本采集器械要求注射器：醫(yī)用〔5和10〕一次性注射器棉拭子：塑料桿全血收集管：10螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)血清保存管：2螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕糞便保存管：5-20螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕-全國網(wǎng)絡(luò)實驗室鼻咽拭子保存管：10螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕痰液保存管：50螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫〔液氮保存〕尸檢組織凍存管：50螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)；尸檢〔每一個樣品換手術(shù)刀〕記號筆：油性，防水標(biāo)本采集器械要求病人標(biāo)本的采集運輸和保藏在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中別離病毒具有很高的診斷價值。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防枯燥。標(biāo)本采集本卷須知標(biāo)本采集本卷須知為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病2-4周后采集。手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進展基因檢測、抗原檢測、血清學(xué)抗體檢測、病毒別離和病鑒定手足口病的實驗室診斷手足口病的實驗室診斷方法病毒別離抗體檢測核酸檢測蛋白/核酸芯片標(biāo)本病毒分離CPE陽性RT-PCR及序列測定腸道病毒非腸道病毒測雙份血清中和抗體滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR檢測病毒核酸序列測定無CPE常規(guī)實驗補充實驗中和定型手足口病的實驗室檢測流程病毒別離培養(yǎng)用于病毒別離的標(biāo)本：包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)病癥，可以采集腦脊液標(biāo)本適用的細胞細胞〔人胚胎橫紋肌肉瘤細胞〕、2細胞〔人喉上皮癌細胞〕病毒別離培養(yǎng)標(biāo)本的處理3、腦脊液和皰疹液：直接接種病毒別離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察：36℃培養(yǎng)逐日觀察，第1代培養(yǎng)見可疑至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待穩(wěn)定出現(xiàn)后,-20℃或-70℃凍存以備進一步鑒定；如果7天之后沒有出現(xiàn)，需盲傳2代繼續(xù)觀察，盲傳2代后仍不出現(xiàn)那么判定為陰性；鑒定：中和試驗血清抗體檢測方法中和實驗、：單份血：急性期：雙份血：急性期，恢復(fù)期陰轉(zhuǎn)陽，四倍升高，四倍降低均可診斷近期感染病毒核酸檢測—()用于病毒的檢測，酶促催化使逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄與第一次在同一系統(tǒng)內(nèi)進展，逆轉(zhuǎn)錄完成后，加熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后開場擴增。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與雜交，然后由依賴的聚合酶催化合成相應(yīng)互補的拷貝，后者能進一步用于擴增。病毒核酸檢測—方法特點：快捷、簡便高度靈敏、特異具有病原診斷意義高效的通用型技術(shù)平臺糞便標(biāo)本：采用氯仿進展處理。肛拭子/咽拭子標(biāo)本：咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分攪動，然后在4℃下，10000離心20。

皰疹液和腦脊液：直接用于提取。標(biāo)本的預(yù)處理可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標(biāo)本中提取病毒簡化操作、標(biāo)準(zhǔn)方法、條件一致、排除干擾〔：52904〕適合臨床標(biāo)本和病毒培養(yǎng)物標(biāo)本〔：74104〕適合組織和咽拭子標(biāo)本的提取引物人腸道病毒〔包括71、16、24v、70〕核酸檢測通用引物2〔上游〕：5`-C-3`1〔下游〕：5`--3`71核酸檢測引物序列：71〔上游〕：5`--3`71〔下游〕：5`--3`引物16核酸檢測引物序列：A16〔上游〕：5`3`A16〔下游〕；5`3`引物根據(jù)自己實驗室的實際情況建立各自反響體系配以下試劑主溶液：反響體系在儀上進展反響，反響步驟如下：42℃························4595℃························395℃························20s50℃························25s×32個循環(huán)72℃························30s72℃························104℃························溫度循環(huán)參數(shù)通過比較標(biāo)本的產(chǎn)物與陽性對照的產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。結(jié)果解釋實驗結(jié)果解釋實驗室診斷原那么人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應(yīng)對血清診斷及病原診斷的實驗室結(jié)果作嚴(yán)格評價，必須結(jié)合臨床病癥及環(huán)境因素流行病學(xué)分析，以確立病毒與疾病的病原學(xué)關(guān)系。一般采取的原那么為：〔1〕病毒別離陽性率遠高于對照人群；〔2〕病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；〔3〕從病變組織中別離出病毒。從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸〔法〕，或別離到病毒或腸道病毒陽性，即可證明是該腸道病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。從疑為死于71〔或其它腸道病毒〕的尸檢標(biāo)本中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或別離到病毒或腸道病毒陽性，即可證明是該腸道病毒是病因。從患者的皰疹液中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或別離到病毒，那么該病毒就是病因病原。實驗結(jié)果的診斷意義實驗結(jié)果的診斷意義當(dāng)無法進展病毒別離或未別離到病毒時，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時引起無病癥感染，只從個別患者糞便標(biāo)本中別離到71〔或其它腸道病毒〕時，不能輕易下結(jié)論71是病因，應(yīng)該擴大樣本量，所以實驗結(jié)果的實際意義應(yīng)結(jié)合臨床過程和流行病學(xué)資料進展解釋。手足口病檢測實驗室相關(guān)問題1、實驗室生物平安問題：必須重視的問題實驗人員受過生物平安培訓(xùn)①有防范潛在生物危害的意識②熟悉生物平安規(guī)程，掌握生物平安技能實驗室自己的生物平安指南合格的生物平安實驗室實驗室文件化的規(guī)程及方法〔包括常規(guī)的和特殊的〕2、實驗室質(zhì)量控制問題：保證實驗結(jié)果可靠的必要手段實驗對照：陽性、陰性、試劑、空白對照控制實驗室核酸污染⑴試劑污染⑵器械污染⑶實驗過程