發(fā)酵大題范圍

參數(shù)檢測(cè)第一頁，共45頁。例：鳥苷消費(fèi)在鳥苷發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵到40小時(shí)后鳥苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使發(fā)酵過程pH下降，補(bǔ)入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是進(jìn)展以下一些測(cè)定與分析第二頁，共45頁。什么因素導(dǎo)致pH下降？1、有機(jī)酸的積累有機(jī)酸積累pH下降補(bǔ)加氨水在正常代謝情況下，細(xì)胞通過EMP途徑和TCA循環(huán)的過程是為細(xì)胞合成提供前體和能量的，按照細(xì)胞經(jīng)濟(jì)學(xué)的原則不會(huì)供過于求，即不會(huì)出現(xiàn)有機(jī)酸的積累若發(fā)酵后期有機(jī)酸積累會(huì)引起加入的[NH4+]積累，相應(yīng)出現(xiàn)產(chǎn)苷速率下降?！x不正常第三頁，共45頁。測(cè)定以下中間物發(fā)酵后期丙酮酸積累第四頁，共45頁。2、氨基酸的積累在有機(jī)酸分析的根底上進(jìn)一步通過HPLC測(cè)定發(fā)酵過程中不同時(shí)間發(fā)酵液中氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總氨基酸積累并且其積累晚于有機(jī)酸和[NH4+]積累。第五頁，共45頁。氨基酸成分分析說明，初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高，其它氨基酸濃度都較低，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)展谷氨酸很快被用于菌體合成，在8小時(shí)之前已經(jīng)降到很低程度，并始終維持在低程度，而在48小時(shí)左右丙氨酸開場(chǎng)出現(xiàn)明顯的積累，發(fā)酵液中積累量到達(dá)初始量的12.6倍之多，其它十余種氨基酸濃度那么變化不大，并且在整個(gè)發(fā)酵過程中都維持在較低程度。因此，丙氨酸濃度變化可能是導(dǎo)致代謝流遷移所致。第六頁，共45頁。3、分析原因發(fā)酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉(zhuǎn)化而來，因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累，丙酮酸隨后轉(zhuǎn)化為丙氨酸丙氨酸本身又會(huì)對(duì)谷氨酸合成酶〔GS〕造成反響抑制和阻遏，使產(chǎn)苷速率降低。第七頁，共45頁。惡性循環(huán)激活磷酸果糖激酶丙酮酸積累氨水補(bǔ)加增加[NH4+]積累抑制GS抑制TCA循環(huán)丙酮酸積累EMP流量增加丙氨酸積累第八頁，共45頁。〔二〕代謝流遷移的酶學(xué)證明糖代謝途徑關(guān)鍵酶糖酵解途徑〔EMP〕在糖酵解途徑中有兩個(gè)不可逆的步驟的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時(shí)序分析第九頁，共45頁。12小時(shí)時(shí)由于生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期，代謝活力較低，所以PFK的活力相對(duì)較低。24小時(shí)后隨著發(fā)酵過程進(jìn)入平穩(wěn)產(chǎn)物形成期和細(xì)胞生長(zhǎng)期，磷酸果糖激酶的活力也根本保持平穩(wěn)。但是到40小時(shí)以后，鳥苷形成速率減慢甚至停頓，同時(shí)觀察到氨基酸和有機(jī)酸積累，PFK相對(duì)酶活增加，這說明此時(shí)通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加。第十頁，共45頁。丙酮酸激酶時(shí)序分析第十一頁，共45頁。丙酮酸激酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活增加，而是在24小時(shí)就根本上到達(dá)其最大值，隨后維持在恒定的程度，這說明在糖代謝時(shí)EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代謝流遷移的主要因素磷酸戊糖途徑〔HMP〕關(guān)鍵酶磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6－磷酸葡萄糖脫氫生成6－磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。第十二頁，共45頁。6－磷酸葡萄糖脫氫酶時(shí)序分析由圖可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高，這可能是前期菌體合成代謝比較活潑，通過HMP途徑合成用于細(xì)胞成分的核酸等組成物質(zhì)；隨后根本不變，從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡，此時(shí)穩(wěn)定持續(xù)的形成產(chǎn)物；但是到40小時(shí)后，6－磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，并且隨著后期發(fā)酵過程的進(jìn)展而持續(xù)下降。根據(jù)物料平衡原那么，有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加。第十三頁，共45頁。三羧酸(TCA)循環(huán)的關(guān)鍵酶三羧酸循環(huán)是“消耗〞丙酮酸的途徑，三羧酸流量大丙酮酸不會(huì)積累。三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶為檸檬酸合成酶，其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，是三羧酸循環(huán)的啟動(dòng)步驟，也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點(diǎn)，由檸檬酸合成酶所催化的反響是三羧酸循環(huán)中的第一個(gè)限速步驟。第十四頁，共45頁。檸檬酸合成酶時(shí)序分析第十五頁，共45頁。從圖可以看到，TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶檸檬酸合成酶在整個(gè)發(fā)酵過程中，尤其是在后期產(chǎn)苷速率下降的過程中都維持比較平穩(wěn)的程度，這說明在發(fā)酵過程后期所發(fā)生的代謝流遷移時(shí)，TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加。即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間，主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的。EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現(xiàn)象。第十六頁，共45頁。丙氨酸脫氫酶的時(shí)序分析第十七頁，共45頁。在發(fā)酵中后期，丙氨酸脫氫酶活力出現(xiàn)了明顯的增加。丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時(shí)序增加相吻合，這些數(shù)據(jù)說明代謝流的溢流現(xiàn)象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點(diǎn)，通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸，從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡。結(jié)果參加EMP途徑的抑制劑，抑制了代謝流遷移的問題，進(jìn)步了鳥苷的產(chǎn)量第十八頁，共45頁?；蚬こ叹谑彭?，共45頁。〔三〕基因不穩(wěn)定性消費(fèi)的目的是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的才能的細(xì)胞一般生長(zhǎng)得快得多，從而能替代有消費(fèi)才能的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性?；虻牟环€(wěn)定性原因：別離喪失構(gòu)造不穩(wěn)定性宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變第二十頁，共45頁。1、別離喪失指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。為什么會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒喪失呢？質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)?！?gt;20拷貝/細(xì)胞〕和低拷貝質(zhì)?！灿袝r(shí)低到每個(gè)細(xì)胞一至二個(gè)拷貝〕。低拷貝質(zhì)粒有專門的機(jī)制保證在子代細(xì)胞中有相等的分配，高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細(xì)胞。對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，絕大多數(shù)子細(xì)胞承受一些質(zhì)粒，也有可能有的細(xì)胞沒有承受質(zhì)粒，出現(xiàn)質(zhì)粒喪失。雖然形成無質(zhì)粒細(xì)胞的可能性是低的〔每百萬細(xì)胞分裂中一個(gè)〕。第二十一頁，共45頁。在大的反響器中含有非常多的細(xì)胞，總會(huì)存在無質(zhì)粒細(xì)胞，例如1000L發(fā)酵液，每毫升有109個(gè)細(xì)胞，總共就有1015個(gè)細(xì)胞，那么在這個(gè)反響器中就含有109個(gè)無質(zhì)粒細(xì)胞。質(zhì)粒的別離喪失受許多環(huán)境因素影響，如溶氧、溫度、培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質(zhì)粒也會(huì)形成多聚體，它是一樣質(zhì)粒附著在一起形成一個(gè)單位。第二十二頁，共45頁。別離喪失示意圖第二十三頁，共45頁。2、質(zhì)粒構(gòu)造不穩(wěn)定性指外源基因從質(zhì)粒上喪失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。假如質(zhì)粒發(fā)生突變，仍保存了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。而且由于不合成外源蛋白，生長(zhǎng)得比原來的工程菌更快，使得在這種培養(yǎng)物中帶有突變質(zhì)粒的菌占統(tǒng)治地位，這種培養(yǎng)情況就是構(gòu)造不穩(wěn)定性。第二十四頁，共45頁。3、宿主細(xì)胞突變

宿主細(xì)胞的突變也會(huì)造成消費(fèi)才能的下降。這些突變通常改變細(xì)胞調(diào)節(jié)，結(jié)果減少目的蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，利用宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子，假如宿主細(xì)胞啟動(dòng)子的改變，將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的消費(fèi)程度。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過參加乳糖或它的構(gòu)造類似物〔如IPTG〕來啟動(dòng)表達(dá)，假如乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會(huì)阻止乳糖或乳糖的構(gòu)造類似物進(jìn)入細(xì)胞，從而不能啟動(dòng)細(xì)胞的表達(dá)。第二十五頁，共45頁。4、生長(zhǎng)速率占優(yōu)勢(shì)的不穩(wěn)定性所有這三種因素的關(guān)鍵是變異了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主-載體系統(tǒng)的生長(zhǎng)速率不同。假如變異了的宿主載體系統(tǒng)比原來的宿主-載體系統(tǒng)有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，那么變異了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢(shì)，基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn)?！菜摹潮磉_(dá)的誘導(dǎo)基因工程菌的產(chǎn)物表達(dá)需要誘導(dǎo)，誘因主要有：溫度誘導(dǎo)、乳糖或乳糖構(gòu)造類似物誘導(dǎo)、氧饑餓誘導(dǎo)、葡萄糖饑餓誘導(dǎo)、甲醇誘導(dǎo)等。第二十六頁，共45頁。進(jìn)步質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1、兩階段培養(yǎng)法：第一階段使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中參加選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)。2、通過控制環(huán)境參數(shù)〔溫度、PH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度〕，調(diào)節(jié)比生長(zhǎng)速率，使工程菌生長(zhǎng)具有優(yōu)勢(shì)。有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反響慢，因此間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比生長(zhǎng)速率，可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第二十七頁，共45頁。染菌第二十八頁，共45頁。3、不同時(shí)間染菌對(duì)發(fā)酵的影響污染時(shí)間是指用無菌檢測(cè)方法確準(zhǔn)的污染時(shí)間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時(shí)間。雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長(zhǎng)、繁殖的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時(shí)間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時(shí)間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時(shí)間就長(zhǎng)。第二十九頁，共45頁?！?〕種子培養(yǎng)期染菌由于接種量較小，消費(fèi)菌生長(zhǎng)一開場(chǎng)不占優(yōu)勢(shì)，而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素〔產(chǎn)物〕或只有很少抗生素〔產(chǎn)物〕。因此它防御雜菌才能低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。第三十頁，共45頁。〔2〕發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物〔抗生素〕或產(chǎn)生很少，抵御雜菌才能弱。在這個(gè)時(shí)期要特別警覺以制止染菌的發(fā)生。染菌措施可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。假如前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)，重新接種再用。第三十一頁，共45頁?！?〕發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌會(huì)嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停頓，有時(shí)甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時(shí)也會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，親密注意代謝變化情況。假如發(fā)酵單位到達(dá)一定程度可以提早放罐，或者抗生素消費(fèi)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第三十二頁，共45頁?！?〕發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅才能。因此假如染菌不多，對(duì)消費(fèi)影響不大。假如染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提早放罐。第三十三頁，共45頁。帶圖題第三十四頁，共45頁。谷氨酸正常發(fā)酵與異常發(fā)酵溶解氧變化第三十五頁，共45頁。氧氣第三十六頁，共45頁。實(shí)例一對(duì)黃色短桿菌生物合成氨基酸時(shí)發(fā)現(xiàn)：菌體的臨界溶氧濃度為當(dāng)溶氧濃度低于時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響，但苯丙氨酸，纈氨酸和亮氨酸最正確合成的溶氧濃度分別為、和。第三十七頁，共45頁。從合成途徑中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來自于三羧酸循環(huán)(TCA)的中間體，而苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸來自于糖酵解的中間體，即來自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。第三十八頁，共45頁。溫度第三十九頁，共45頁。在四環(huán)素發(fā)酵中，還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強(qiáng)度的變化有對(duì)應(yīng)關(guān)系，特別是在80小時(shí)以前。從此實(shí)驗(yàn)中還可看到，當(dāng)產(chǎn)生的生物熱到達(dá)頂峰時(shí)，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可從菌體的耗氧率來衡量生物熱的大小。四環(huán)素生物合成過程中系列參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化過程1：效價(jià)；2：呼吸強(qiáng)度；3：生物熱；4：糖濃度第四十頁，共45頁。第二題第四十一頁，共45頁。1、微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜構(gòu)造物理化學(xué)性質(zhì)有親密關(guān)系根據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型，細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài)，只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細(xì)胞的正常生理功能，使細(xì)胞處于最正確生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關(guān)性的原理第四十二頁，共45頁。2、蛋白質(zhì)構(gòu)造人們采用二種方案來研究酶在低溫條件下的構(gòu)造完好性和催化功能：(1)通過自然或誘導(dǎo)突變，將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然構(gòu)造進(jìn)展比照；(2)比照同屬嗜熱、嗜溫及嗜冷菌的蛋白構(gòu)造通過對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析說明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強(qiáng)，酶構(gòu)造的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導(dǎo)產(chǎn)生催化作用第四十三頁，共45頁。嗜冷菌具有在0℃合成蛋白質(zhì)的才能。這是由于其核糖體、酶類以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng)，蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì)，一方面是由于其