2015版無(wú)菌檢查法

2015版無(wú)菌檢查法姜珊2014.10.07無(wú)菌檢查法無(wú)菌檢查法系用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染環(huán)境潔凈度2010版無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度

10000級(jí)下的局部潔凈度

100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行2015版無(wú)菌檢查應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2～25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。培養(yǎng)基PH區(qū)別2010版2015版改良馬丁培養(yǎng)基調(diào)節(jié)

pH

值使滅菌后為

6.4

±

0.2

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH使滅菌后pH值為7.3±0.2營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基調(diào)節(jié)

pH

值使滅菌后為

7.2

±

0.2

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH

值使滅菌后為

7.2±0.2沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基調(diào)節(jié)

pH值使滅菌后為

6.4±0.2沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2培養(yǎng)基的適用性檢查無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。無(wú)菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的適用性檢查靈敏度檢查菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。培養(yǎng)基適用性檢查直觀區(qū)別2010版2015版相應(yīng)菌種接種所用培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度23～28℃20～25℃稀釋液0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7

支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。培養(yǎng)基接種直觀區(qū)別2010版2015版硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌改良馬丁培養(yǎng)基5支白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉方法適用性試驗(yàn)菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。方法適用性試驗(yàn)薄膜過(guò)濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5

天，各試驗(yàn)菌同法操作。方法適用性試驗(yàn)結(jié)果判斷與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。供試品的無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。供試品的無(wú)菌檢查檢驗(yàn)數(shù)量檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量檢驗(yàn)量是指供試品每個(gè)最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g或ml）。供試品的無(wú)菌檢查陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法適用性試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。陰性對(duì)照供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。供試品的無(wú)菌檢查薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過(guò)濾器。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過(guò)1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。供試品的無(wú)菌檢查水溶液供試品取規(guī)定量，直接過(guò)濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無(wú)菌容器中，混勻，立即過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗(yàn)。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。供試品的無(wú)菌檢查培養(yǎng)及觀察將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；一份置30～35℃培養(yǎng)，一份置20～25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。培養(yǎng)及觀察直觀區(qū)別2010版2015版培養(yǎng)

14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)

2天、真菌培養(yǎng)

3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁供試品的無(wú)菌檢查結(jié)果判斷陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無(wú)效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：（1）無(wú)