《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑(2020年版)》

公告附件1《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養(yǎng)素補充劑（2020年版（征求意見稿》序號序號保健功能備注1234567891011121314有助于增強免疫力功能有助于抗氧化功能輔助改善記憶功能緩解視覺疲勞功能清咽潤喉功能有助于改善睡眠功能緩解體力疲勞功能耐缺氧功能后有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能有助于改善骨密度功能改善缺鐵性貧血功能有助于改善痤瘡功能有助于改善皮膚水份狀況功能1515161718192021222324有助于調節(jié)腸道菌群功能有助于消化功能有助于潤腸通便功能輔助保護胃粘膜功能有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）功能有助于維持血糖健康水平功能后有助于維持血壓健康水平功能對化學性肝損傷有輔助保護功能對電離輻射危害有輔助保護功能有助于排鉛功能《保健食品功能評價方法（2020年版）（征求意見稿》目錄第一部分、保健食品評價試驗項目、試驗原則及結果判1一、有助于增強免疫力功能 1二、有助于抗氧化功能 1三、輔助改善記憶功能 2四、緩解視覺疲勞功能 3五、清咽潤喉功能 3六、有助于改善睡眠功能 4七、緩解體力疲勞功能 4八、耐缺氧功能 5九、有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能 5十、有助于改善骨密度功能 6十一、改善缺鐵性貧血功能 7十二、有助于改善痤瘡功能 7十三、有助于改善黃褐斑功能 8十四、有助于改善皮膚水份狀況功8十五、有助于調節(jié)腸道菌群功8十六、有助于消化功能 9十七、有助于潤腸通便功能 10十八、輔助保護胃粘膜功能 11十九、有助于維持血脂健康水平（膽固甘油三酯）功能 11二十、有助于維持血糖健康水平功13二十一、有助于維持血壓健康水平功14二十二、對化學性肝損傷有輔助保護功14二十三、對電離輻射危害有輔助保護功15二十四、有助于排鉛功能 16第二部分功能學檢驗方法 17一、有助于增強免疫力功能檢驗方17二、有助于抗氧化功能檢驗方30三、輔助改善記憶功能檢驗方51四、緩解視覺疲勞功能檢驗方62五、清咽潤喉功能檢驗方法 65六、有助于改善睡眠功能檢驗方71七、緩解體力疲勞功能檢驗方74八、耐缺氧功能檢驗方法 80九、有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能檢驗方82十、有助于改善骨密度功能檢驗方86十一、改善缺鐵性貧血功能檢驗方93十二、有助于改善痤瘡功能檢驗方104十三、有助于改善黃褐斑功能檢驗方106十四、有助于改善皮膚水份狀況功能檢驗方108十五、有助于調節(jié)腸道菌群功能檢驗方110十六、有助于消化功能檢驗方115十七、有助于潤腸通便功能檢驗方十八、輔助保護胃粘膜功能檢驗方124十九、有助于維持血脂健康水平（膽固甘油三酯）功能檢驗方法 128二十、有助于維持血糖健康水平功能檢驗方134二十一、有助于維持血壓健康水平功能檢驗方144二十二、對化學性肝損傷有輔助保護功能檢驗方147二十三、對電離輻射危害有輔助保護功能檢驗方154二十四、有助于排鉛功能檢驗方162PAGEPAGE26第一部分、保健食品評價試驗項目、試驗原則及結果判定有助于增強免疫力功能試驗項目體重臟器//體重比值細胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，遲發(fā)型變態(tài)反應實驗體液免疫功能測定：抗體生成細胞檢測，血清溶血素測定—巨噬細胞功能測定：小鼠碳廓清實驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗NK細胞活性測定試驗原則所列指標均為必做項目。采用正?；蛎庖吖δ艿拖碌哪Ｐ蛣游镞M行實驗。結果判定有助于增強免疫力功能判定：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于增強免疫力功能作用。其中細胞免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量—NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定NK細胞活性結果陽性。有助于抗氧化功能試驗項目動物實驗體重脂質氧化產(chǎn)物：丙二醛或血清表氫氧異前列腺素（8-Isoprostane）蛋白質氧化產(chǎn)物：蛋白質羰基抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化物質：還原型谷胱甘肽人體試食試驗脂質氧化產(chǎn)物：丙二醛或血清表氫氧異前列腺素（8-Isoprostane）超氧化物歧化酶谷胱甘肽過氧化物酶試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列的指標均為必測項目。脂質氧化產(chǎn)物指標中丙二醛和血清標中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶任選其一進行指標測定。氧化損傷模型動物和老齡動物任選其一進行生化指標測定。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定受試樣品有助于抗氧化功能動物實驗結果陽性。體健康無影響，可判定該受試樣品具有有助于抗氧化功能的作用。輔助改善記憶功能試驗項目動物實驗體重跳臺實驗避暗實驗穿梭箱實驗水迷宮實驗人體試食試驗指向記憶聯(lián)想學習圖象自由回憶無意義圖形再認人像特點聯(lián)系回憶記憶商試驗原則動物實驗和人體試食試驗為必做項目?？啃浴Ｕ游锱c記憶障礙模型動物任選其一。動物實驗應重復一次（重新飼養(yǎng)動物，重復所做實驗。人體試食試驗統(tǒng)一使用臨床記憶量表。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定動物實驗：跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗四項實驗中任二項實驗結果陽性。且重復實驗結果一致（所重復的同一項實驗兩次結果均為陽性結果陽性。人體試食試驗：記憶商結果陽性，可判定該受試樣品具有輔助改善記憶功能的作用。緩解視覺疲勞功能人體試食試驗項目調查；于試驗前進行一次胸片、心電圖、腹部B超檢查。明視持久度視力試驗原則60天。所列指標均為必做項目。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定試驗組自身比較或試驗組與對照組組間比較，癥狀改善且癥狀總積分差異有顯著性P<0.0。試驗組自身比較或試驗組與對照組組間比較，明視持久度差異有顯著性<0.0510%。具備4.3.1及4.3.2可判定該受試物具有緩解視覺疲勞功能。清咽潤喉功能試驗項目動物實驗體重大鼠棉球植入實驗大鼠足趾腫脹實驗小鼠耳腫脹實驗人體試食試驗：咽部癥狀、體征試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。應對臨床癥狀、體征進行觀察。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定可判定該受試樣品清咽功能動物實驗結果為陽性。征的改善率明顯增加，可判定該受試樣品具有清咽潤喉功能。有助于改善睡眠功能試驗項目體重延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗戊巴比妥鈉（或巴比妥鈉）閾下劑量催眠實驗巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗試驗原則所列指標均為必做項目。需觀察受試樣品對動物直接睡眠的作用。結果判定延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉（或巴比妥鈉）期實驗三項實驗中任二項陽性，且無明顯直接睡眠作用，可判定該受試樣品具有有助于改善睡眠功能的作用。緩解體力疲勞功能實驗項目動物體重負重游泳實驗血乳酸血清尿素肝糖原或肌糖原試驗原則動物實驗所列指標均為必做項目。實驗前必須對同批受試樣品進行違禁藥物的檢測。運動實驗與生化指標檢測相結合。結果判定/受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。耐缺氧功能試驗項目體重常壓耐缺氧實驗亞硝酸鈉中毒存活實驗急性腦缺血性缺氧實驗試驗原則所列指標均為必做項目。結果判定判定該受試樣品具有耐缺氧功能的作用。有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能試驗項目動物實驗體重、體重增重攝食量、攝入總熱量體內(nèi)脂肪重量（睪丸及腎周圍脂肪墊）脂/體比人體試食試驗體重腰圍、臀圍體內(nèi)脂肪含量試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。動物實驗中大鼠肥胖模型法和預防大鼠肥胖模型法任選其一。減少體內(nèi)多余脂肪，不單純以減輕體重為目標。引起腹瀉或抑制食欲的受試樣品不能作為有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能食品。每日營養(yǎng)素攝入量應基本保證機體正常生命活動的需要。對機體健康無明顯損害。實驗前應對同批受試樣品進行違禁藥物的檢測。試食試驗。不替代主食的有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能試驗，應對試食前后的受試者膳食和運動狀況進行觀察。每日膳食進行營養(yǎng)學評估。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定/體比低于模型對照組，差異人體試食試驗：有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能的作用。脂肪四個點中至少有兩個點減少，腰圍與臀圍之一減少，且差異有顯著性P<0.0，微量元素、維生素營養(yǎng)學影響，可判定該受試樣品具有有助于調節(jié)體內(nèi)脂肪功能的作用。有助于改善骨密度功能試驗項目動物實驗：分為方案一（補鈣為主的受試物）和方案二（不含鈣或不以補鈣為主的受試物）兩種。體重骨鈣含量骨密度試驗原則根據(jù)受試樣品作用原理的不同，方案一和方案二任選其一進行動物實驗。所列指標均為必做項目。范圍內(nèi)的鈣源及來自普通食品的鈣源（如可食動物的骨、奶等，可以不進行鈣的吸收率實驗。結果判定方案一照組，可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。方案二助于改善骨密度功能的作用。不以補鈣為主（可少量含鈣）低于相應劑量的碳酸鈣對照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對照組，可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。改善缺鐵性貧血功能試驗項目動物實驗體重血紅蛋白/紅細胞游離原卟啉人體試食試驗血紅蛋白血清鐵蛋白/血清運鐵蛋白飽和度試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。針對兒童的人體試食試驗，只測血紅蛋白和紅細胞內(nèi)游離原卟啉。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定/試樣品改善缺鐵性貧血功能動物實驗結果為陽性。人體試食試驗品具有改善缺鐵性貧血功能作用。/蛋白飽和度二項指標一項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血功能作用。有助于改善痤瘡功能人體試食試驗項目痤瘡數(shù)量皮損狀況皮膚油份試驗原則所列的指標均為必做項目。試驗前后應針對固定皮膚范圍內(nèi)的痤瘡數(shù)量及皮損狀況進行分析。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定試食組痤瘡數(shù)量明顯減少且大于等于20％，皮損程度積分明顯減少，差異均有顯著性，皮膚油份不顯著增加，可判定該受試樣品具有有助于改善痤瘡功能的作用。有助于改善黃褐斑功能人體試食試驗項目黃褐斑面積黃褐斑顏色試驗原則所列的指標均為必做項目。試驗前后應針對固定皮膚范圍內(nèi)的黃褐斑面積及顏色進行分析。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定試食組黃褐斑面積明顯減少且大于等于斑，可判定該受試樣品具有有助于改善黃褐斑功能的作用。有助于改善皮膚水份狀況功能人體試食試驗項目：皮膚水份試驗原則皮膚水份值的測定點試驗前后應保持一致。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定功能的作用。有助于調節(jié)腸道菌群功能試驗項目動物實驗體重雙歧桿菌乳桿菌腸球菌腸桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌人體試食試驗雙歧桿菌乳桿菌腸球菌腸桿菌擬桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。正常動物或腸道菌群紊亂模型動物任選其一。受試樣品中含雙歧桿菌、乳桿菌以外的其它益生菌時，應在動物和人體試驗中加測該益生菌。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定動物實驗：符合以下任一項，可判定該受試樣品有助于調節(jié)腸道菌群功能動物實驗結果陽性。/或乳桿菌（或其它益生菌）變化。/或乳桿菌（或其它益生菌）/增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其它益生菌）增加的幅度。人體試食試驗：符合以下任一項，可判定該受試樣品具有有助于調節(jié)腸道菌群功能的作用。/或乳桿菌（或其它益生菌）菌無明顯變化。/或乳桿菌（或其它益生菌）/桿菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其它益生菌）增加的幅度。有助于消化功能試驗項目動物實驗體重、體重增重、攝食量和食物利用率小腸運動實驗消化酶測定人體試食試驗兒童方案食欲食量偏食狀況體重血紅蛋白含量成人方案臨床癥狀觀察胃/腸運動實驗試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。根據(jù)受試樣品的適用人群特點在人體試食試驗方案中任選其一。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定面實驗結果陽性，可判定該受試樣品有助于消化功能動物實驗結果陽性。人體試食試驗指標結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于消化功能的作用。助于消化功能的作用。有助于潤腸通便功能試驗項目動物實驗體重小腸運動實驗排便時間糞便重量糞便粒數(shù)糞便性狀人體試食試驗癥狀體征糞便性狀排便次數(shù)排便狀況試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。除對便秘模型動物各項必測指標進行觀察外，還應對正常動物進行觀察，不得引起動物明顯腹瀉。排便次數(shù)的觀察時間試驗前后應保持一致。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定定該受試樣品有助于通便功能動物實驗結果陽性。具有有助于潤腸通便功能的作用。輔助保護胃粘膜功能試驗項目動物實驗體重胃粘膜損傷大體觀察胃粘膜組織病理學檢查人體試食試驗臨床癥狀體征胃鏡觀察試驗原則驗所列指標均為必做項目。無水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜損傷模型或冰醋酸致慢性胃潰瘍模型任選其一進行動物實驗。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的安全性作進一步的觀察。結果判定可判定該受試樣品具有輔助保護胃粘膜功能的作用。有助于維持血脂健康水平（/甘油三酯）功能根據(jù)血脂異常的類型，有助于維持血脂健康水平（甘油三酯）分類的動物實驗和人體試食試驗。試驗項目根據(jù)受試樣品的作用機制，分成三種情況有助于維持血脂健康水平功能：同時維持血總膽固醇和血甘油三酯健康水平有助于維持血膽固醇健康水平功能：單純維持血膽固醇健康水平有助于維持血甘油三酯健康水平功能：單純維持血甘油三酯健康水平觀察指標體重血清總膽固醇血清甘油三酯血清高密度脂蛋白膽固醇血清低密度脂蛋白膽固醇人體試食試驗血清總膽固醇血清甘油三酯血清高密度脂蛋白膽固醇血清低密度脂蛋白膽固醇試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必測項目。根據(jù)受試樣品的作用機制，可在動物實驗的兩個動物模型中任選一項。根據(jù)受試樣品的作用機制，可在人體試食試驗的三個方案中任選一項。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定動物實驗：混合型高脂血癥動物模型有助于維持血脂健康水平（甘油三酯）三酯升高，血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高，差異均有顯著性，判定模型成立。各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，且任一劑量組血清甘油三酯降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平動物實驗結果陽性。各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結果陽性。各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清甘油三酯降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇不顯著高于模型對照組，血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血甘油三酯健康水平功能動物實驗結果陽性。高膽固醇血癥動物模型模型對照組和空白對照組比較，血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高，差異有顯著性，血清甘油三酯總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異有顯著性，并且各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結果陽性。人體試食試驗指標判定標準：有效：TC降低>10%或降至正常；TG降低>15%或降至正常；HDL-C上升>0.104mmol/L。無效：未達到有效標準者。有助于維持血脂健康水平（甘油三酯）功能結果判定可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平（/甘油三酯）人體試食試驗結果陽性。有助于維持血膽固醇健康水平功能結果判定膽固醇有效率顯著高于對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能人體試食試驗結果陽性。有助于維持血甘油三酯健康水平功能結果判定性。有助于維持血糖健康水平功能試驗項目動物實驗分為方案一（胰島損傷高血糖模型）和方案二（胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型）兩種方案一（胰島損傷高血糖模型）體重空腹血糖糖耐量方案二（脂代謝紊亂模型）體重空腹血糖糖耐量胰島素總膽固醇甘油三酯人體試食試驗空腹血糖2小時血糖糖化血紅蛋白或糖化血清蛋白總膽固醇甘油三酯試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。根據(jù)受試樣品作用原理不同，方案一和方案二動物模型任選其一進行動物實驗。除對高血糖模型動物進行所列指標的檢測外，應進行受試樣品對正常動物空腹血糖影響的觀察。人體試食試驗可在臨床治療的基礎上進行。應對臨床癥狀和體征進行觀察。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定動物實驗：樣品有助于維持血糖健康水平動物實驗結果陽性。方案二：空腹血糖和糖耐量二項指標中一項指標陽性，血脂（總膽固醇、甘油三酯）正常動物空腹血糖無影響，即可判定該受試樣品有助于維持血糖健康水平功能動物實驗結果陽性。人體試食試驗：空腹血糖、餐后2小時血糖、糖化血紅蛋白（或糖化血清蛋白、血脂四項指標均無顯著升高，且空腹血糖、餐后2樣品具有有助于維持血糖健康水平功能的作用。有助于維持血壓健康水平功能試驗項目動物實驗體重血壓心率人體試食試驗臨床癥狀與體征血壓心率試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。動物實驗應選擇高血壓模型動物和正常動物進行所列指標的觀察。人體試食試驗可在臨床治療的基礎上進行。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定判定該受試樣品有助于維持血壓健康水平功能動物實驗結果陽性。壓健康水平功能的作用。對化學性肝損傷有輔助保護功能試驗項目動物實驗分為方案一（四氯化碳肝損傷模型）和方案二（酒精肝損傷模型）兩種。方案一（四氯化碳肝損傷模型）體重谷丙轉氨酶谷草轉氨酶肝組織病理學檢查方案二（酒精肝損傷模型）體重丙二醛還原型谷胱甘肽甘油三酯肝組織病理學檢查試驗原則所列指標均為必做項目。根據(jù)受試樣品作用原理的不同，方案一和方案二任選其一進行動物實驗。結果判定方案一（四氯化碳肝損傷模型可判定該受試樣品具有對化學性肝損傷有輔助保護功能作用。方案二（酒精肝損傷模型：①肝臟MD、GSTG三項指標結果陽性，可判定該受試樣品對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能，②肝臟MDAGSHTG判定該受試樣品具有對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能作用。對電離輻射危害有輔助保護功能實驗項目體重外周血白細胞計數(shù)骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)小鼠骨髓細胞微核實驗血／組織中超氧化物歧化酶活性實驗血清溶血素含量實驗實驗原則外周血白細胞計數(shù)、骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)、小鼠骨髓細胞微核實驗、血／組織中超氧化物歧化酶活性實驗、血清溶血素含量實驗中任選擇三項進行實驗。結果判定在外周血白細胞計數(shù)、骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù)、小鼠骨髓細胞微核、血／組織中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五項實驗中任何二項實驗結果陽性，可判定該受試樣品具有對電離輻射危害有輔助保護功能的作用。有助于排鉛功能試驗項目動物實驗體重血鉛骨鉛肝組織鉛人體試食試驗血鉛尿鉛尿鈣尿鋅試驗原則動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。應對臨床癥狀、體征進行觀察。對尿鉛進行多次測定，以了解體內(nèi)鉛的排出情況。在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。結果判定受試樣品動物實驗結果為陽性。于總尿鉛排出增加的幅度，可判定該受試樣品具有有助于排鉛功能的作用。第二部分功能學檢驗方法一、有助于增強免疫力功能檢驗方法實驗動物推薦用近交系小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。劑量分組及受試樣品給予時間實驗設三個劑量組和一個陰性對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組，另設二個劑量組，必要時設陽性對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。免疫模型動物實驗時間可適當延長。實驗方法ConA可任選下列方法之一MTT法原理當T淋巴細胞受ConA刺激后發(fā)生母細胞發(fā)生增殖反應，活細胞特別是增殖細胞中的線粒體水解酶可將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結晶，其光密度值能反映細胞的增殖情況。儀器和材料RPMI16402巰基乙醇2-MConHank'sPBS緩沖液（pH7.2-7.4）紗布或2002496孔培養(yǎng)板（平底721光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌器、無菌濾器。實驗步驟試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入101谷氨酰胺200mmol/，青霉素（100U/m100μg/及5×105mol/L的21mol/L的HCl或1mol/L的NaOH調pH至7.0-7.2，即完全培養(yǎng)液。ConA液用雙蒸水配制成100μg/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱無菌Hank's3.5%的無菌NaHCO3pH7.2-7.4。MTT5mgMTT1mLpH7.2的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液96mL4mL1mol/LHCl，臨用前配制。脾細胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩4Hank's液洗210mi1000r/mi1mL的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95以上，調整細胞濃度為×16個/m。淋巴細胞增殖反應將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1m，一孔加75μLA液（相當于7.5μg/m，5%CO2，37℃CO272h4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg/mL）50μL4h1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到963個平570nm2mL分光光度計上在570nm測定OD值。數(shù)據(jù)處理及結果判定F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結果陽性。注意事項本實驗中ConA的濃度很重要，過低不能刺激足夠的細胞增殖，過高會抑制細胞增殖，不同批號的ConA在實驗前要進行預試，以找到最佳濃度。同位素摻入法原理T淋巴細胞在有絲分裂原PHAConARNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入H－胸腺嘧啶核苷H-Td映淋巴細胞增殖的程度。儀器和材料RPMI-164022-MConHank'sPBS（pH7.2-7.3H-Td[2,5PP0.51,4-5苯基惡唑基POPO）0.25g500mL混勻]20096孔培養(yǎng)板（平底49型玻璃纖維濾紙。實驗步驟脾細胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗3次，每次離心10mi（1000r/mi。然后將細胞懸浮于2mL用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95以上，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液將細胞數(shù)調成×16個/m。淋巴細胞增殖反應2將脾細胞懸液加入到96200μL63孔加3個孔不加ConA作為對照。置5%CO72h，培養(yǎng)結束前6h，每孔加入3H-TdR20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細胞收集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)cp。2數(shù)據(jù)處理及結果判定0.05F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。0.05以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示SI=實驗孔cpm對照孔cpm受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值，即可判定該項實驗結果陽性。遲發(fā)型變態(tài)反應可任選下列方法之一二硝基氟苯誘導小鼠DTH（耳腫脹法）原理二硝基氟苯T淋巴細胞增殖成致敏淋巴4～724～48h程度可以反應映遲發(fā)型變態(tài)反應程度。材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器。實驗步驟試劑配制DNFB溶液DNFB5mL丙酮麻油溶液（=：，倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封?；靹蚝?，用250μL，用DNFB50μL均勻涂抹致敏。DTH的產(chǎn)生與測定5DNFB10μL（兩面24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。數(shù)據(jù)處理與結果判定F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項實驗結果陽性。注意事項操作時應避免DNFB與皮膚接觸。綿羊紅細胞誘導小鼠DTH（足跖增厚法）原理SRBCTSRBC腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應程度。材料游標卡尺（精密度0.02mSRB、微量注射器50μ。實驗步驟致敏小鼠用2（v/SRBC腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射0.2m（約×18個SRB。DTH的產(chǎn)生與測定免疫后4每只鼠20μ（約×108個SRB，注射后于24h測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。數(shù)據(jù)處理和結果判定0.05一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)<F0.05，結論：各組均數(shù)間差異無顯著性值≥F，P≤ ，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法0.050.05行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。以攻擊前后足跖厚度的差值來表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值，可判定該項實驗結果陽性。注意事項攻擊時所用的SRBC要新鮮1周?？贵w生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）原理經(jīng)過綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的SRBC混合，在補體參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。溶血空斑數(shù)可反映抗體生成細胞數(shù)。儀器和材料200SRBC（豚鼠血清RPMI1640SA緩沖液、瓊脂糖。實驗步驟SRBC 2周。制備補體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清，將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以SA緩沖液按1：8－15稀釋。玻片涂膜在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂糖0.5g瓊脂糖加雙蒸水至100m，加熱溶解，干后可長期保存?zhèn)溆谩Ｃ庖邉游锶∶摾w維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，計數(shù)細胞，每只鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射SRBC5×107～2×108個。也可將壓積SRBC2%（v/v）的細胞懸液，。脾細胞懸液制備SRBC4～5天后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hank's2004層紗布將脾磨碎，離心Hank's液洗2遍，最后將細胞懸浮在5mLRPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細胞，并將細胞濃度調整為5x106個8mLHank's液?？瞻叩臏y定將表層培養(yǎng)基瓊脂糖加雙蒸水至100mL）加熱溶解后，放45～50℃水浴保溫，與等量pH7.2～7.42倍濃度的Hank's0.5m50μL10%（v/SA緩沖液配制，20μL脾細胞懸液（5×106個/mL）或25μL脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1～1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1：8）加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1～1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。數(shù)據(jù)處理及結果判定0.05F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F，P0.050.05行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。/105/該項實驗結果陽性。血清溶血素的測定可任選下列方法之一。血凝法原理用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素，利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平。儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機實驗步驟SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。3次，每次離心。將壓積SRBC用生理鹽水配成的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL4～51h10min，收集血清。凝集反應用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100μL100μL0.5%（v/v）SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37數(shù)據(jù)處理及結果判定F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。血清凝集程度一般分為5級（0－IV）照組的抗體水平，可判定該項實驗結果陽性?？贵w水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。級紅細胞大部分沉集在孔底成園點狀，四周有少量凝集的紅細胞。級凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。IIIIV級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。注意事項血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。半數(shù)溶血值的測定原理用SRBC免疫動物后，血清中出現(xiàn)SRBC抗體（溶血素，在補體參與下，與SRBC溶血反應，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。儀器和材料721SRBC、補體（豚鼠血清SA緩沖液、都氏試劑（1.0g0.2g0.05g實驗步驟SRBC2周。制備補體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清，將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以SA液按1：8稀釋。3次，每次離心。將壓積SRBC用生理鹽水配成的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL4～51h，使血清充分析出，2000r/min10min6000r/min，4min，收集血清。溶血反應分光光度計法取血清用SA緩沖液稀釋（200～500倍1mL10%（v/v）SRBC0.5mLSA1:8稀釋。另設不加血清的對照管（SA緩沖液代替3715～30min2000r/min10%（v/v）SRBC0.25mL4mL10min處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。酶標儀法設樣品孔和空白對照孔，樣品孔：取血清用SA緩沖液稀釋（一般20～500倍；每孔10%（v/v）SRBC25μL，補體50（用SA溶液按1:8稀釋3℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30mi1500r/min水平離心10mi，然后樣品孔和空白對照孔各取上清液50μL96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加都氏試劑。同時設半數(shù)溶血孔10%（v/v）SRBC12.5μL200μL10min540nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。3.4.2.4數(shù)據(jù)處理及結果判定0.05一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)<F0.05，結論：各組均數(shù)間差異無顯著性值≥F ，P≤ ，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法0.050.05行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。HC HC 溶血素的量以半數(shù)溶血（ 表示按下列公式計算HC HC 50 50 50可判定該項實驗結果陽性。HC＝ 樣品光密度值HC50 SRBC

×稀釋倍數(shù)小鼠碳廓清實驗原理在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指函數(shù)關系。以血碳濃度對數(shù)值為縱坐標，時間為橫坐標，兩者呈直線關系。此直線斜率（K）物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a表示。儀器和試劑721分光光度計、計時器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3實驗步驟溶液配制注射用墨汁將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3～4倍。Na2CO3溶液取0.1gNa2CO3，加蒸餾水至100mL。注射墨汁按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁10ml/k，待墨汁注入，立即計時。測定2，并立即將其加到2mL721分光光度計在600nm波長處測光密度值O，以Na2C3溶液作空白對照，也可用酶標儀在600nm測光密度值O。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項實驗結果陽性。lgOD－lgOD1 2K＝───────t－t2 1吞噬指數(shù)a＝

體重 k肝重+脾重k數(shù)據(jù)處理及結果判定0.05F值，F(xiàn)<F0.05，結值≥F，P0.050.05行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。注意事項靜脈注入碳粒的量、取血時間、取血量一定要準確。墨汁放置中，碳?？沙劣谄康?，臨用前應搖勻。使用新的墨汁時，應在實驗前摸索一個最適墨汁注入量，即正常小鼠在20min內(nèi)不易廓清?？扇芜x下列方法之一。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（滴片法）原理噬率和吞噬指數(shù)，據(jù)此判定巨噬細胞的吞噬能力。儀器和材料：顯微鏡、37℃孵箱、計數(shù)器、手術器械一套、注射器、滴管、膠頭吸管、吸耳球、載玻片、染色槽、試管玻片處理巨噬細胞粘附和鏡檢。在玻片上標號，用3%瓊脂（配方見試劑部分）每個玻片上劃兩個圓圈（圓圈必須全封閉，否則液體會流出，晾干備用。搪瓷或塑料盒：內(nèi)墊半濕紗布（用溫水濕透，置于孵箱內(nèi)備用，紗布一定要平整。試劑配制方法3.6.1.2.3.1取瓊脂3g，加水100mL，加熱煮沸至透明，加入1%的溴甲酚紫指示劑1－2滴。3.6.1.2.3.2PBS緩沖液的配制方法：KH2PO46.66g，Na2HPO4·12H2O6.38g，將上述試劑溶于1000mL蒸餾水中調pH值至7.2即成。3.6.1.2.3.31%雞紅細胞懸液：實驗前取雞頸靜脈或動脈血，置于盛有玻璃珠個左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個方向充分搖動5～10min3次，1500r/min，離心10min按血球壓積用Hank’液配制成1的紅細胞懸液。Giemsa染液：取Giemsa染料0.5g，中性甘油，甲醇。先將Giemsa55～602小時，不斷搖勻，再加入甲醇搖勻，保存?zhèn)溆?。稀釋姬姆薩氏染色液：使用時，用pH6.881份，即成應用液。Giemsa2NHCl2滴即成。實驗步驟實驗前42%。用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2mL于試管內(nèi)（或用注射器1mL0.5mL0.5mL1%雞血紅細胞懸液的試管內(nèi)，混勻。用注射器（裝大針頭）0.5mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15－20分鐘。孵育結束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，于甲醇液1分鐘，Giemsa15分鐘。用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用40×顯微鏡計數(shù)吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率為每100雞紅細胞的個數(shù)。3.6.2.4.注意事項頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大，防止腹腔內(nèi)血管和內(nèi)臟破裂出血影響實驗結果。放滴片的搪瓷盤內(nèi)應保持一定的濕度，以防液體干燥。孵育后的標本沖洗次數(shù)的差別不宜太大，更不要直接沖在有細胞的部分。實驗操作過程中應嚴格掌握時間。在鏡下計數(shù)細胞時要數(shù)完一個視野后再換另一個視野。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（半體內(nèi)法）原理在體內(nèi)腹腔巨噬細胞能吞噬雞紅細胞。據(jù)此判斷巨噬細胞的吞噬功能。儀器和材料顯微鏡、雞紅細胞、丙酮、甲醇、生理鹽水、Giemsa染液。實驗步驟水洗滌23次，離心2000r/mi，10mi，去上清，用生理鹽水配成20v/）的雞紅細胞懸液。20%30min-1.5h，頸椎脫臼處死動物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水，轉動鼠板1min。然后吸出腹腔洗液2片載玻片上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi)，移置3730min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細胞。晾干，以1:1再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)巨噬細胞，每張片計數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率（%）=

吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)×100計數(shù)的巨噬細胞數(shù)吞噬指數(shù)=

被吞噬的雞紅細胞總數(shù)計數(shù)的巨噬細胞數(shù)在計數(shù)時，應同時觀察雞紅細胞被消化的程度。借以判定巨噬細胞吞噬與消化功能，通常分為4級：I級：未消化。被吞噬的雞紅細胞完整，胞質淺紅或淺黃帶綠色，胞核淺紫色。II級：輕度消化。胞質淺黃綠色、胞核固縮呈紫藍色。級：重度消化。胞質淡染，胞核淡淺灰色?？梢?。數(shù)據(jù)處理及結果判定p以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。吞噬百分率需進行數(shù)據(jù)轉換，p式中PF

，結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F

，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組0.05 0.05求后，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的吞噬百分率或吞噬指數(shù)與對照組比較，差異均有顯著性，方可判定該項實驗結果陽性。NK細胞活性測定可任選下列方法之一乳酸脫氫酶測定法原理正常情況下，活細胞胞漿內(nèi)的含有LDH不能透過細胞膜，當細胞受到NK細胞的殺傷后，LDH釋放到LDH可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽還原碘硝基氯化四氮唑藍ININT接受H490nm儀器和材料YAC-1Hank's液（pH7.～7.4、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、碘硝基氯化受試樣品組的NK受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，可判定該項實驗結果陽性。PAGE27INPMNA0.2mol/L的Tris-HClpH8.1%NP40或2.5%Triton實驗步驟LDH乳酸鋰5×10-2mol/L碘硝基氯化四氮唑藍吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8×10-4mol/L1.3×10-3mol/L將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH8.2）靶細胞的傳代細胞）實驗前24h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)。用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為4×105個/mL。脾細胞懸液的制備（效應細胞）無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，或用4層紗布將脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次離心10mi（1000r/mi。棄上清將細胞0.5mL200.5mL2Hank’s8mLHank’s液，1000r/min，10min離心；或采用N4Cl-Tris紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心10mi1000r/mi，棄紅色上清。用1mL含10小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1冰醋酸稀釋后計數(shù)（活細胞數(shù)應在95以上蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95以上，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為×17個/m。NK細胞活性檢測取靶細胞和效應細胞各100μ（效靶比50:，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和1%NP402.5%Triton375%CO2961500r/min100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH100μL3~10min1mol/LHCl30μL，在酶標儀490nm處測定光密度值O。NK細胞活性，受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK實驗結果陽性。NK細胞活(%)＝反應孔自然釋放孔OD 最大釋放孔OD-自然釋放孔OD數(shù)據(jù)處理及結果判定NK細胞活性需進行數(shù)據(jù)轉換，X＝Sin-1

pPNK細胞活性，用小數(shù)表示，然后再進行方差pF值<F0.05，結論：各組均數(shù)間差異無值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，可判定該項實驗結果陽性。PAGE28注意事項靶細胞和效應細胞必須新鮮，細胞存活率應大于95%。反應時環(huán)境溫度應保持恒定。LDH基質液應臨用前配制。在一定范圍內(nèi)，NK細胞活性與效靶比值成正比。一般效靶比值不應超過100。3H-TdR測定法1.3.7.2.1原理將用同位素3H-TdR標記的靶細胞與淋巴細胞共同培養(yǎng)時，靶細胞可被NKNK3H-TdR的釋放率即可反應NK細胞的活性。3.7.2.2儀器和材料3H-TdRRPMI1640Hank's液7.4AC-1TritonX-100實驗步驟靶細胞的標記24h生長良好的YAC-1細胞（>95%）1×106/mLYAC-13H-TdR10uCi進375%CO22h30min131×105個。脾細胞懸液的制備（效應細胞）無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗3次，每次離心10mi（1000r/mi。然后將細胞懸浮于2mL臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95以上，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為1107個/m。NK細胞活性測定96100μL100μL100μL100μL2.5%Triton。每個樣品設3個復孔，置5%CO2374h，用多頭細胞收集器將細胞收集在玻璃纖維濾紙上，用液體閃爍儀進行測量。按下式計算NK細胞活性：實驗孔cpmNK細胞活性(%)=（1－──────────────────）×100%空白對照孔cpm－最大釋放孔cpm3.7.2.4數(shù)據(jù)處理及結果判定NKXSi-1pP為NKFF值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。PAGEPAGE57有助于增強免疫力功能結果判定有助于增強免疫力功能判定：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有有助于增強免疫力功能作用。其中細胞免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量—NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定NK細胞活性結果陽性。二、有助于抗氧化功能檢驗方法動物實驗實驗動物選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠，也可用氧化損傷模型鼠。單一性別，小鼠每組10－15只，大鼠8－12只。劑量分組及受試樣品給予時間10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個劑量組，另設兩個劑量組，高劑量一般不超過3030天，必要時可延長至45天。實驗方法老齡動物108MDA13個受試3產(chǎn)物含量、蛋白質羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。D－半乳糖氧化損傷模型原理D-氧化效應。造模方法25-30gD-40mg－1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為0.1mL/10g16周，取血測，按MDA水平分組。隨機分13個劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積D-驗結束處死動物測脂質氧化產(chǎn)物含量、蛋白質羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。乙醇氧化損傷模型原理乙醇大量攝入，激活氧分子產(chǎn)生自由基，導致組織細胞過氧化效應及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。造模方法25－30g（180－220g大鼠43必要時可增設13個劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30316（過夜150%12mL/kgB，6小時后取材（空白對照組不作處理，不禁食取材含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。脂質氧化產(chǎn)物測定血中過氧化脂質降解產(chǎn)物丙二醛含量測定血中過氧化脂質降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量可采用熒光法和比色法測定，方法任選其一。熒光法熒光法原理1個丙二醛2個硫代巴比妥酸分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復合物。以波長536nm為激發(fā)光，在550nm有最強熒光強度?？捎脽晒夥ㄟM行微量測定。儀器與試劑儀器：熒光分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管試劑：10mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，棕色瓶4℃保存12個月，臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸EDTA2H2O谷胱甘肽（還原型）

0.209g25mg1mg用0.02mol/L NaOH 50mL溶解（微溫助溶，棕色瓶4℃保存2周）酸水解液0.1mol/LH2SO4mol/L

125mL125mL加水150mL用H2SO4調pH1.5，加水稀釋至500mL正丁醇50%24h后，再經(jīng)蒸餾水、雙蒸水淋洗干燥，試劑（選AR級）用雙蒸水配制。實驗步驟樣品制備全血上清液：取血50μL加入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測。血清樣品：取血0.5mL室溫靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液待測。標準曲線制作10nmol/mL0.00.250.51.0、1.5、2、5、10nmol/mL分別取0.1mL2mLTBA0.5mL→混勻，避光、沸水浴60min正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液（正丁醇層）測熒光強度（1.5nm，出射狹縫激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm）以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖。樣品測定試劑空白管樣本管標準管10mL具塞離心管0.1mL蒸餾水0.1mL血清*0.1mL標準＃酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻正丁醇

3mL

3mL

3mL1min，3000r/min5min*全血上清液0.5mL（空白管加蒸餾水0.5mL，標準管加標準0.1mL、蒸餾水0.4mL）＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（標準）血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混勻，避光、沸水浴60min→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液（正丁醇層）測熒光強度（入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm）計算公式：B-A B-A過氧化脂質含量（nmol/mL血清）＝———×C×K=————×1×1F-A F-AB-A B-A 1過氧化脂質含量（nmol/mL血液）＝———×C×K=———×1×————F-A F-A 0.05A：空白管熒光度B：樣品熒光度C：四乙氧基丙烷濃度（1nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)比色法1.3.4.1.2.11個丙二醛2個硫代巴比妥酸分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復合物。該物質532nm有極大吸收峰。可用分光光法進行測定。儀器與試劑試劑：0.2MpH3.5M乙酸溶液 185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（℃保存3個月，臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉 1920mL0.2M磷酸二氫鉀 480mL實驗步驟樣品制備20μL0.98mL1.3.4.1.2.3.2樣品測定試劑空白管樣品管標準管2%溶血液*0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。*若用血清，樣品管0.15mL，標準管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計算B–A B–A過氧化脂質含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×C×K=—————×40×1F–A F–AB–A B–A過氧化脂質含量（nmol/mL血清）＝————×C×K=—————×40×1F–A F–AA:空白管吸光度B：樣品吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)組織中過氧化脂質降解產(chǎn)物丙二醛含量測定原理見1.3.4.1.2.1儀器與試劑織勻漿器試劑：見1.3.4.1.2.2實驗步驟樣品制備組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10，間歇30，反復進行3次，制成10組織勻漿W/3000r/min5－10min，取上清液待測。樣品測定試劑空白管樣品管標準管10%組織勻漿0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行計算B-A B-A 1過氧化脂質含量＝————×C×K=———×40×—————————（nmol/mg組織） F-A F-A 0.2×10%×1000A：空白管吸光度B：樣品管吸光度C：四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)異前列腺素（8-Isoprostane）測定原理8-表氫氧-異前列腺素（8-Isoprostane）間接反應因機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而導致組織細胞的脂質過氧化程度。儀器與試劑儀器：酶標儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機試劑：8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標準品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman’s試劑實驗步驟1.3.4.3.3.1小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，3000r/min10min。取上清液，用EIA151.3.4.3.3.2樣品測定按試劑盒說明操作。培養(yǎng)清洗418清洗所有反應孔五次培養(yǎng)讀數(shù)用封板膜蓋好酶標板，并在常溫避光條件下培養(yǎng)45-90分鐘412nm處測量各孔吸光度0.3-1.0A.U培養(yǎng)清洗418清洗所有反應孔五次培養(yǎng)讀數(shù)用封板膜蓋好酶標板，并在常溫避光條件下培養(yǎng)45-90分鐘412nm處測量各孔吸光度0.3-1.0A.U范圍）步驟試劑空白TANSBB0標準/樣品1.加試劑EIA緩沖液--100μL50μL-標準/樣品50μLAChE示蹤物--50μL50μL50μL抗體血清50μL50μL4.加試劑AChE示蹤物-5μLEllman’s200μL200μL200μL200μL200μL標準或樣品孔吸光度—NSB孔吸光度%B/B0= ——————————————————×100B0孔吸光度—NSB孔吸光度以標準物的濃度的對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線，亦可將數(shù)據(jù)轉換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]%B/B0的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中的表氫氧異前列腺素濃度。蛋白質氧化產(chǎn)物測定H2O2或O2·ˉ自由基對蛋白質氨基酸側鏈的氧化可導致羰基產(chǎn)物的積累使肽鏈斷裂，引起蛋白質一級結構的破壞，在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質的功能，蛋白質羰基含量可直接反映蛋白質損傷的程度。蛋白質羰基形成是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，它隨著年齡的增長而增加。血清中蛋白質羰基測定原理被氧化后的蛋白質羰基含量增多，羰基可與2,4-二硝基苯肼反應生成2,4-二硝基苯腙，2,4-二硝基苯腙為370nm羰基含量。儀器與試劑儀器：紫外分光光度計、酶標儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機、混旋器、2mL離心管。試劑：10mmol/L 2,4-二硝基苯(DNPH)99mg50ml2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸胍無水乙醇乙酸乙酯混合應用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1：1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。操作步驟試劑試劑血清（血漿）10mmol/L 2，4-二硝基苯肼測定管0.1mL0.4mL對照管0.1mL2mol/LHCL 0.4mL渦旋混勻1分鐘，37℃準確避光反應30分鐘200g/L三氯乙酸 0.5mL 0.5mL渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL混勻后，37℃準確水浴15分鐘1.25mL12000r/min離心15min370nmmol/LOD值。用雙縮脲法測定血清（或血漿）蛋白質含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質羰基含量=——————————————————————×125×105（nmol/mgprot） 22×比色光徑樣本蛋白濃度組織中蛋白質羰基測定原理見1.3.5.1.1儀器與試劑2mL離心管。試劑：10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38gN-22HEPE1000mlNNaOH調p至7.4℃保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素，溶入10mL雙蒸餾水，4℃避光保存。10mmol/L 2，4-(DNPH)99mg50mL2mol/LHCL溶解，4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸（TCA）6mol/L鹽酸胍無水乙醇乙酸乙酯混合應用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1：1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。實驗步驟樣品處理0.1g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加入0.9mL10mmol/LHEPES液pH7.，制成10的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉速，離心10mi，保留上清。取100g/L的硫酸鏈霉素溶液50μ，加入上清液450μv/v,1:，室溫放置10min后，以11000r/min的轉速，離心10mi，取上清液待測。操作步驟試劑試劑組織勻漿上清液測定管對照管2，4-二硝基苯肼0.1mL0.4mL0.1mL10mmol/L2mol/LHCL0.4mL渦旋混勻1分鐘，37℃準確避光反應30分鐘200g/L三氯乙酸 0.5mL 0.5mL渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 1.0mL渦旋混分鐘，4℃下，12000r/min離心10min，棄上清，留沉無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀無水乙醇乙酸乙酯混合應用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻1分鐘，以4℃下，以12000r/min離心10min，棄上清，留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL混勻后，37℃準確水浴15分鐘1.25mL12000r/min離心15min370nmmol/LOD值。用雙縮脲法測定勻漿上清液蛋白質含量。注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質羰基含量=——————————————————————×125×105（nmol/mgprot） 22×比色光徑樣本蛋白濃度注意事項DNPH結合，并反應生成的溶解：DNPH2mol/LDNPHHC1與反應液中一些物質反應生成對比色有影響的物質。DNPHDNPH分解，體系中會有剩余的沒有變成蛋白質腙衍生物，對反應比色有影響。DNPH在370nmDNPH，否則，會增加吸光值?？寡趸富盍y定SOD催化超氧陰離子自由基（O2·ˉ）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除O2·ˉ對細胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動物某些器官和人體血紅細胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。血或組織中超氧化物歧化酶活力測定原理O2·ˉ氧化羥胺的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長530nm處有極大吸收峰，可用分光光度法進行測定，當SOD消除O2·ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。儀器與試劑儀器可見光分光光度計、酶標儀、離心機、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.810mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2g/L黃嘌呤氧化酶取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲萘胺0.2g40mL50mL110mL0.33%對氨基苯磺酸0.66g150mL50mLSOD標準品三氯甲烷95%乙醇（v/v）0.9%生理鹽水實驗步驟全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min0.2mL95%0.1mL30s0.1mL1min，4000r/min離3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s301組織勻漿（最好用超聲波發(fā)生器處理使線粒體振破，以中性紅－詹鈉氏綠B4000r/min5min20μL待測。SOD標準抑制曲線將SOD750U/mL50量為15U/m（1.5μg/mSODSOD活力單位U/mL為橫坐標繪制標準曲線。對照管OD－測定管ODSOD百分抑制率＝─────────────────×100%對照管OD計算每mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個單位。（對照管OD-測定管OD）×100%對照管OD 反應液總量SOD活力（U/mL）＝────────────────── ×────────────×樣品稀釋倍數(shù)50% 取液量也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標準曲線查出相應的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)（1mL/取樣量。若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。樣品測定步驟：試劑 測定管 對照管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8（mL）1.01.0樣品A*10mmol/L鹽酸羥胺（mL）0.10.17.5mmol/L黃嘌呤（mL）0.20.20.2mg/mL黃嘌呤氧化酶（mL）0.20.2雙蒸水（mL）0.490.490.33%對氨基苯磺酸（mL）0.1%甲萘胺（mL）

混勻，372.02.0

2.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調零，530nm處比色測定OD值。*A所用樣品的量紅細胞抽提液血清（或血漿1%組織勻漿

10μL20－30μL（溶血樣品剔除）10－40μL注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。血或組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力測定原理內(nèi)自由基引起膜脂質過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應速度，及單位時間內(nèi)GSH5,5’-二硫對硝基苯甲酸反應在GSH-Px離子，于423nmGSH減少的量，由于GSH應氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。試劑和儀器儀器：可見光分光光度計、酶標儀、低溫高速離心機、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑：疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN316.25mg終濃度2.5mmol/LEDTA-Na27.44mg終濃度0.2mmol/LNa2HPO41.732g終濃度0.2mol/LNaH2PO41.076g終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCl、NaOH調pH7.0，4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽（還原型GSH）溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1－2日。1.25－1.5mmol/LH2O2溶液取30%H2O20.15－0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4℃避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTANaCl

16.7g（先用蒸餾水溶解）0.5g280g