上游順式作用元件的研究方法

上游順式作用元件的研究方法

mega順式作用元件（Cis-actingelements）指同一DNA分子中具有轉錄調節(jié)功能的特異DNA序列，即具有特殊功能的轉錄因子DNA結合位點和其他調控基序。順式作用元件能夠被特異轉錄因子識別和結合，從而影響基因表達活性。順式作用元件的作用是參與基因表達的調控，本身不編碼任何蛋白質,僅僅提供一個作用位點,要與反式作用因子相互作用而起作用。

按功能特性分為通用調節(jié)元件：啟動子、增強子、沉默子和絕緣子專一性元件：應答元件，如激素應答元件等啟動子(Promoter)概念：啟動子是基因序列中決定轉錄起始的部位。包括核心啟動子和上游啟動子元件。一個基因可同時擁有一個及以上啟動子；一般在轉錄起始點上游，位于5‘端上游100-200bp左右，是決定轉錄起始點及轉錄頻率的關鍵元素；可與增強子共同控制轉錄起始和強度；發(fā)揮功能時需RNA聚合酶外，還需轉錄調控因子與啟動子區(qū)各種調控元件相互作用。由兩部分組成：核心啟動子（CPE)：指保證RNApolⅡ轉錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上游-25—-30bp的TATA盒。它單獨起作用時，只能確定轉錄起始位點并產生基礎水平的轉錄；上游啟動子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒等，能通過TFⅡD復合物調節(jié)轉錄起始的頻率，提高轉錄效率。增強子(enhancer)

指能夠提高轉錄效率、遠距離調控基因轉錄的上游DNA序列,它間接的把信號從激活因子傳到轉錄蛋白。特點：（1）它能通過啟動子大幅度地增加同一條DNA鏈上靶基因轉錄的頻率，一般能增加10～200倍，有的甚至可達千倍。（2）增強子的作用對同源或異源的基因同樣有效，如把SV40的增強子連接到兔β-珠蛋白的基因上，可使轉錄強度增大100倍；（3）增強子的位置可在基因5’上游、基因內或其3’下游的序列中，增強效益與其位置和取向無關；（4）增強子所含核苷酸序列大多為重復序列，其內部含有的核心序列，對于它進入到另一宿主之后重新產生增強子效應至關重要；（5）增強子一般都具有組織和細胞特異性；（6）增強子在DNA雙鏈中沒有5’與3’固定的方向性；（7）增強子可遠離轉錄起始點，通常在1～4kb（個別情況可達30kb）外起作用；（8）增強子的活性與其在DNA雙螺旋結構中的空間方向性有關。另外，許多增強子還受到外部信號的調控，如金屬硫蛋白基因的增強子就可對環(huán)境中的鋅、鎘濃度作出反應。從機能上講，沒有增強子存在，啟動子通常不能表現(xiàn)活性；沒有啟動子時，增強子也無法發(fā)揮作用。有時，對結構密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動子、增強子樣結構統(tǒng)稱啟動子。通常描述的、具有獨立的轉錄活性和決定基因時間、空間特異性表達能力的啟動子就是這類定義的啟動子。沉默子(silencer)

是可以抑制基因表達的順式元件,包括沉默子元件和負調控因子(NRE),分別指導主動和被動抑制作用。特點：負性調節(jié)元件，與增強子作用相反不受序列方向影響，同時也能遠距離發(fā)揮作用本身不能實現(xiàn)衰減作用，必須通過對前導序列的翻譯才能實現(xiàn)，衰減作用的實質是以翻譯手段控制基因的轉錄。絕緣子（Insulator）一種負調控元件，參與基因表達的負調控。干擾增強子與啟動子的相互作用，并抑制啟動子的激活活性。應答元件另一類位于基因上游能被轉錄因子識別和結合,調控基因專一性表達的DNA序列。如熱激應答元件、激素應答元件,cAMP應答元件等。應答元件含有短重復序列,不同基因中應答元件的拷貝數(shù)相近。蛋白因子結合在應答元件的保守序列上,通常位于轉錄起點上游200bp內；應答元件也有位于啟動子或增強子內。研究順式作用元件結構的方法①5’端缺失系列分析法

通過從一側逐段缺失來確定啟動子的邊界.當一段缺失不會阻礙RNA合成,而下一段缺失使轉錄不再發(fā)生時,那么我們可以確定啟動子的邊界必然存在于兩者之間.

常用于測定哺乳動物基因調控區(qū)的上游邊界。爪蟾5SrRNA基因的Ⅲ類啟動子分析實驗操作：首先，確定啟動子的5’端。對爪蟾5SrRNA基因的5’端序列進行逐漸缺失，每次缺失序列的長度都會增長，有此獲得5’端長度不等的系列5SrRNA基因突變體，體外觀察突變對基因轉錄的影響。通過凝膠電泳測定轉錄產物的大小，依次判斷轉錄的正確與否。該基因的正常轉錄產物長度為120bp。泳道a：未發(fā)生序列缺失的陽性對照泳道b-j：序列缺失后的基因泳道k：陰性對照（pBR322DNA，無

5SrRNA基因序列）5’-序列缺失對5SrRNA基因轉錄的影響

②接頭掃描突變法

可以找出存在于基因轉錄起始位點和5’端邊界之間的所有調控元件方法的基礎是構建一系列序列重疊的調控區(qū)突變體，每個突變體內各有一個短序列的核苷酸序列被打亂然后分別轉染培養(yǎng)細胞，或微量注入爪蟾卵母細胞，并分析它們對報告基因的影響接頭掃描突變法機制對皰疹病毒的胸苷激酶基因啟動子的研究方法：用長度為10bp的接頭對胸苷激酶基因啟動子序列進行系統(tǒng)替換，產生不同的突變體，然后將突變DNA分子注入蛙暖母細胞，同時也注入類似野生型的DNA（在+21至+31處發(fā)生突變），這種野生型突變啟動子與正常野生型啟動子一樣，具有正常的起始轉錄活性，可作為內參。最后，通過凝膠電泳測定轉錄產物的大小，