植物表達載體構(gòu)建

植物表達載體構(gòu)建張玉剛zyg4458@163.com載體vector表達載體載體克隆載體原核表達載體真核表達載體植物表達載體質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建啟動子外源基因終止子啟動子報告基因終止子

（標(biāo)記基因）

目的片段選擇標(biāo)記

載體表達載體(expressingvector)特點：帶表達構(gòu)件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達載體：含啟動子—核糖體結(jié)合位點—克隆位點—轉(zhuǎn)錄終止信號啟動子：trp-lac(tac)啟動子、λ噬菌體PL啟動子、T7噬菌體啟動子核糖體結(jié)合位點(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列在植物表達載體Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：侵染植物的土壤農(nóng)桿菌中帶有Ti質(zhì)粒，侵染植物后會產(chǎn)生冠癭瘤。Ti質(zhì)粒上有一段transfer-DNA,長為12-24kb，能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中。Virgene復(fù)制起始位點冠癭堿代謝基因右邊界(25bp)左邊界生長素基因細胞分裂素基因冠癭堿合成基因Vir基因產(chǎn)物可誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈線性拷貝，在其他如VIRD2,VIRD4,VIRB等蛋白的協(xié)助下，穿越農(nóng)桿菌及植物細胞的細胞壁、膜等，最后整合到染色體中。T-DNA的左右邊界各有25bp的重復(fù)序列，但右邊界對T-DNA的整合更為重要。有一些早期的植物轉(zhuǎn)化載體并不含有左邊界。T-DNA區(qū)域的大部分基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才表達，表達產(chǎn)物與冠癭瘤的形成有關(guān)。Ti質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)基因載體的缺陷：---轉(zhuǎn)化后會產(chǎn)生植物激素，阻礙轉(zhuǎn)化細胞的再生；---冠癭堿合成基因?qū)D(zhuǎn)基因植物意義不大；----Ti質(zhì)粒長約200-800kb,過于龐大；----Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制。

雙元載體不帶有vir基因，但帶有大腸桿菌及土壤農(nóng)桿菌的復(fù)制起始位點。所有基因操作可以在大腸桿菌中完成，之后轉(zhuǎn)入一種經(jīng)修飾后的Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌中，該Ti質(zhì)粒包含一整套vir,但缺失T-DNA序列而無法轉(zhuǎn)移，這樣可提供僅vir基因產(chǎn)物幫助雙元載體轉(zhuǎn)移。

共整合載體已很少用。外源基因首先克隆到一個克隆載體上，該載體含有一段與缺失T-DNA的Ti質(zhì)粒有同源序列。當(dāng)該載體進入土壤農(nóng)桿菌后，與Ti質(zhì)粒整合，然后由Ti質(zhì)粒提供T-DNA向植物細胞轉(zhuǎn)移的vir基因產(chǎn)物。病毒衍生載體比較小，易侵染植物并大量擴增，可大量表達蛋白，但一般難于整合到植物基因組中。

啟動子35S,Nos,others蛋白質(zhì)定位：GFP融合蛋白，GUS融合蛋白基因表達：啟動子-GUS（蛋白）,啟動子-GFP（蛋白）。啟動子的種類組成型啟動子誘導(dǎo)型啟動子組織特異型啟動子在某些情況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性Constitutivepromoter在該類型啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達大體恒定在一定水平下，在不同組織部位表達水平?jīng)]有明顯差異。特點：表達具持續(xù)性；tRNA和蛋白質(zhì)表達量相對恒定；它們不表現(xiàn)時空特異性；不受外界因素的誘導(dǎo)；從結(jié)構(gòu)上看，大多數(shù)組成型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾百個核苷酸處，存在有六聚體花紋（hexamermotifs)序列TGACTG。它們以重復(fù)形式出現(xiàn)并被6-8個核苷酸隔開，缺失及點突變分析表明六聚體花紋的存在對維持啟動子的轉(zhuǎn)錄活性是必要的。CaMV35S啟動子來自花椰菜花葉病毒，由于啟動整個CaMV基因組的一小段重疊序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S，故將編碼該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的啟動子稱之為35S啟動子。該啟動子包括TATA盒、CAAT盒、倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列和增強子核心序列（GTGG/TTTG）。35S可以劃分為兩個區(qū)域：A區(qū)：-90~+8主要負責(zé)在胚根、胚乳的根及根組織內(nèi)表達；B區(qū)：-343~-90主要控制胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達。B區(qū)內(nèi)的增強子序列可以提高表達水平，如果35S啟動子中存在兩個B區(qū)將能使35S啟動子的活性提高10倍，并對異源啟動子也有作用。-75處TGACGT核苷酸的重復(fù)的花紋結(jié)構(gòu)對啟動子表達能力有作用，如果其突變，將引起核因子與其結(jié)合力下降，導(dǎo)致啟動子表達能力減弱。CaMV35S啟動子加上來自AMV的一段44bp的引導(dǎo)序列，可使其表達強度增加5倍（44bp序列是翻譯增強序列）。將加倍的CaMV35S啟動子與AMV引導(dǎo)序列結(jié)合構(gòu)成一個復(fù)合串聯(lián)啟動子，比未修飾的啟動子表達增強20倍。Tissuespecificpromoter在這些啟動子調(diào)控下，基因的表達只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并通常表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號為存在基礎(chǔ)。與誘導(dǎo)型啟動子有一定的共同點。馬鈴薯塊莖特異蛋白基因啟動子小麥胚乳特異表達的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucosepyrphosphorylase)啟動子番茄果實成熟特異性表達的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)啟動子花粉特異表達基因啟動子（lat52）木質(zhì)部特異表達的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)啟動子Induciblepromoter在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，此種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此，稱為誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)序列。共同特點啟動子的活化受到物理或化學(xué)信號的誘導(dǎo)；啟動子的分子結(jié)構(gòu)都具有增強子、沉默子或類似功能的序列結(jié)構(gòu)；感受特異性誘導(dǎo)的序列都有明顯的專一性；一部分該類型的啟動子同時具有組織特異性表達的特點；該類啟動子常以誘導(dǎo)信號命名，可分為光誘導(dǎo)表達基因啟動子、熱誘導(dǎo)表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達基因啟動子、真菌誘導(dǎo)表達啟動子和共生細菌誘導(dǎo)表達基因啟動子。三種類型A型：可以被植物體內(nèi)合成的某些產(chǎn)物包括ABA、生長素、赤霉素以及創(chuàng)傷誘發(fā)產(chǎn)生的系統(tǒng)素所誘導(dǎo)；B型：在高溫、低溫、水淹以及土壤中高濃度的鹽以及重金屬離子等環(huán)境因子的作用下可被誘導(dǎo)；C型：一類能夠?qū)θ斯ず铣傻幕瘜W(xué)誘導(dǎo)物，諸如四環(huán)素、地塞米松等作出反應(yīng)。光誘導(dǎo)啟動子核酮糖二磷酸羧化酶小亞基（SSrbc)基因和光撲獲復(fù)合物a/b結(jié)合蛋白（lightharvestingcomplexproteina/b,LHCPa/b)基因。這兩個基因均由核基因編碼，并在胞漿內(nèi)合成含有信號肽的前體蛋白，最終輸入到葉綠體發(fā)揮生物學(xué)功能。熱誘導(dǎo)啟動子當(dāng)植物暴露在高溫下（通常35以上）或稱熱休克時，植物就會在1-3小時內(nèi)暫時合成一些蛋白質(zhì)或增大特異蛋白質(zhì)的合成量，這些誘導(dǎo)下合成的蛋白質(zhì)成為熱休克蛋白。熱激基因的結(jié)構(gòu)分析：這些基因的5'端有一段保守的熱激共有序列，也稱為熱休克因子序列（HSE）。其含有熱誘導(dǎo)基因表達的調(diào)控序列。植物基因工程常用的報告基因指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定、常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。作為報告基因的條件在轉(zhuǎn)化的寄主細胞中應(yīng)不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性，其表達產(chǎn)物不僅不會損害寄主細胞，而且還應(yīng)具有快速、靈敏、定量和可重復(fù)的檢測特性。報告基因1、綠色熒光蛋白基因（GFPgreenfluorescenceprotein）2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-glucuronidase）3、熒光素酶基因（LUCfireflyluciferase）4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT基因）5、抗生素基因JellyfishAequoreavictoria:oneoftheoldestspeciesontheearth

GreenFluorescentProtein(GFP)

ThisisastereoviewofGFPgeneratedfromtheBrookhavenDatabaseusingRIfyouhavetheChyoumayfollowthelinkstoseeGFPinaction!Lastupdated(c)1997RWZELLERGUS酶的底物是無色的X-葡萄糖苷酸（X-glucuronide,X-gluc)GUS酶的顯色反應(yīng)以底物不同而不同：5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide靛藍5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide橘紅4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide熒光產(chǎn)物B-glucuronidase(GUS)檢測方法用于GUS基因檢測的常用底物有三種：X-Gluc5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯X-MUG4-甲基傘形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯

PNPG對硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷組織化學(xué)染色定位法熒光法測定GUS活性分光光度法測定GUS活性組織化學(xué)染色定位法該方法是將底物進入被測的植物組織。將被檢材料浸泡在含有底物的緩沖葉中保溫，在適宜條件下該酶可將X-Gluc水解生成藍色物質(zhì)。初始產(chǎn)物并不帶有顏色，為無色的吲哚衍生物，后經(jīng)氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯靛藍染料，使具有Gus活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色。注意：在測定時，由于植物體內(nèi)的過氧化物酶能促進氧化二聚作用，使顏色加深，所以染色程度不能準(zhǔn)確反映Gus活性，F(xiàn)igure1a)Maturecoldstoredpotatotubers,transformedandcontrol,stainedforGUSactivity.b)Invitro-grownmicrotubers,transformedandcontrol,stainedforGUSactivityTransgenicArabidopsisstainedforGUSactivityshowingpromoteractivityoftheconstitutivepromoterCaMV35SandB)thePsMTApromoterfrompea

Patternofatao1activityvisualisedbyGUSexpressionfollowinginfectionwitheitherH.schachtiiorM.incognita.LeftTheatao1promoterdrivesGUSexpressionattheboundaryofthesymcytiumofH.schachtii(n).RightInagallinducedbyM.incognita(n)thedisruptedvasculatureshowsstrongexpressionofGUSdrivenbyatao1(gc,giantcells).Left,DownregulationofCaMV35SpromoterinthesyncytiumofHeteroderaschachtiimonitoredbyexpressionofGFP(top).BycomparisonanunifectedrootshowsregularGFPexpression(bottom).Right,ImageanalysisofthemeanredcomponentoffluorescentimagesofaGFP-transformedArabidopsisroot,viewedunderfluorescentconditions.greenbox=meangreenlevelinsidethesyncytium;bluebox=meangreenleveloutsidethesyncytium.熒光素酶基因（LUC）1986年以來，熒光素酶基因被廣泛地用作植物基因工程研究的一種新的報告基因.最常用的是來自熒火蟲的熒光素酶。分子量為60.7KD的單體蛋白質(zhì)多肽，共有550個氨基酸，它編碼的基因luc已經(jīng)被克?。辉谵D(zhuǎn)染的細胞中，熒光素酶蛋白質(zhì)的半衰期比較短，其適用于做瞬時分析。熒光素酶活性測定先用去污劑處理細胞使之裂解，然后加入ATP、Mg2+離子和熒火蟲的熒光素，于是在有氧的條件下，熒光素酶會催化熒光素進行氧化反應(yīng)，產(chǎn)生出AMP、CO2和黃-綠色的光。利用發(fā)光計對熒光素酶反應(yīng)作出定量測定。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT基因）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因cat，是位于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9上的一種抗藥基因。它在真核細胞中并不存在，這一特性使其成為真核生物表達調(diào)控研究中最早使用的報告基因之一。以SB401cDNA為探針篩選馬鈴薯基因組文庫陽性克隆繪制酶切圖譜、亞克隆構(gòu)建測序載體、測序、序列分析啟動子與報告基因連接、轉(zhuǎn)化，研究啟動子的特異性啟動子缺失確定活性區(qū)技術(shù)路線與其它啟動子進行活性比較花粉特異啟動子的克隆1、pGEM--7Z/SacI2、pG701/SacI3、701/SacI4、DNA/H3kb9kbpG701酶切鑒定pG701酶切電泳圖1BamHI2EcoRI3HindIII4SacI5B+S6H+S7E+S8B+E9B+H10E+H11E+B+H12pGSB/H13pGEM-7Zf(+)/S

M12345678910111213pG701酶切southern雜交1BamHI2EcoRI3HindIII4SacI5B+S6H+S7E+S8B+E9B+H10E+H11E+B+H12pGSB/H13pGEM-7Zf(+)/S12345678910111213

RestrictionenzymemapoftheinsertfragmentofpG701B--BamHIE--EcoRIH--HindIIIS--SacIX--XbaI轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)花粉的GFP觀察1-14CK-光學(xué)顯微鏡CK-熒光顯微鏡轉(zhuǎn)基因煙草的冰凍切片的熒光顯微鏡觀察根葉CK-P3啟動子缺失片段與GUS相連構(gòu)建雙元載體35S啟動子與GUS相連構(gòu)建雙元載體(7個）LAT52啟動子與GUS相連構(gòu)建雙元載體19Z啟動子與GUS相連構(gòu)建雙元載體轉(zhuǎn)GUS基因煙草抗性苗轉(zhuǎn)GUS基因煙草苗及植株轉(zhuǎn)基因煙草GUS組織化學(xué)染色（1）LAT52CK-4-51-4萌發(fā)花粉的GUS組織化學(xué)染色（2）LAT52-2CK-4-9GUS基因GUGUS基因組織化學(xué)染色（3）35S-7莖橫切2-2莖橫切轉(zhuǎn)基因