環(huán)境生物學(xué)課件遺傳工程原理與應(yīng)用

1.生物降解的局限性(1）沒有一種微生物可以降解所有的有機(jī)污染物(2）污染物包含各種化學(xué)物質(zhì)，一種微生物也許只能降解混合物的一種成分，而且可能受到別的成分抑制(3)在某些惡劣條件下，微生物難以有效降解污染物(4）許多非極性的化合物可能會(huì)吸附在土壤和沉淀物上,使生物難以降解(5）有些高濃度有機(jī)化合物可以抑制微生物的降解活性或生長第八章：遺傳工程原理及其在生物降解中的應(yīng)用基因操作是解決上述問題的可能途徑?。?.DNA重組技術(shù)原理重組DNA技術(shù)，是達(dá)成基因信息（DNA）在生物體之間轉(zhuǎn)移的一系列實(shí)驗(yàn)流程的簡稱(圖1）。多種方法可以達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。重組DNA實(shí)驗(yàn)通常遵循以下程序:1.供體DNA經(jīng)抽提、酶切、連接到另一個(gè)DNA載體（質(zhì)粒）上，形成一種新的重組DNA分子2.構(gòu)建體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。將DNA導(dǎo)入一個(gè)宿主細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化3.經(jīng)過鑒定選出含有DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞（稱為轉(zhuǎn)化子）4.構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的蛋白質(zhì)

圖2.可同時(shí)降解樟腦、辛烷、二甲苯、萘的菌株的構(gòu)建含有降解樟腦質(zhì)粒的菌株A，與含有降解辛烷質(zhì)粒的菌株B接合，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并發(fā)生同源重組，產(chǎn)生一個(gè)帶有降解樟腦和辛烷的融合質(zhì)粒的菌株E。含有降解二甲苯質(zhì)粒的菌株C，與含有降解萘質(zhì)粒的菌株D接合，產(chǎn)生一個(gè)帶有降解二甲苯質(zhì)粒和降解萘質(zhì)粒的菌株F。菌株E和F接合產(chǎn)生一個(gè)菌株G，它攜帶有一個(gè)降解樟腦和辛烷的融合質(zhì)粒，一個(gè)降解二甲苯質(zhì)粒和一個(gè)降解萘質(zhì)粒。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移（1）混合污染物的降解（2）低溫環(huán)境中的生物降解

大多數(shù)通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)行基因操作的具有降解性能的細(xì)菌是嗜溫細(xì)菌，這些微生物只有在20℃～40℃才可以良好生長。但是被污染的河流、湖泊、海洋通常只有0～20℃。

一種從嗜溫性菌株惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)中的ToL(降解甲苯)質(zhì)粒通過接合作用轉(zhuǎn)入一種耐寒的，并可在0℃時(shí)降解水楊酸的惡臭假單胞菌種。轉(zhuǎn)化后該菌可同時(shí)在低溫下降解水楊酸和甲苯。

轉(zhuǎn)化株攜帶有轉(zhuǎn)入的TOL質(zhì)粒和它自身的SAL質(zhì)粒（降解水楊酸），可以在0℃時(shí)利用水楊酸或者甲苯作為唯一的碳源(表1)，而野生型(未轉(zhuǎn)化)的耐寒惡臭假單孢菌在以甲苯作為唯一碳源的條件下，任何溫度都不能生長

表1.不同溫度下以水楊酸或甲苯為唯一碳源時(shí)野生型（非轉(zhuǎn)化）和轉(zhuǎn)化的耐寒惡臭假單孢菌P.putida的傳代時(shí)間

溫度（℃）傳代時(shí)間野生型+水楊酸轉(zhuǎn)化子+水楊酸轉(zhuǎn)化子+甲苯37沒有生長沒有生長沒有生長302.22.52.0252.13.21.3202.63.81.9153.24.22.9106.35.63.3513.912.912.2018.618.124.4（3）放射環(huán)境中的有機(jī)污染物降解射線對(duì)大多數(shù)微生物細(xì)胞都具有殺滅作用,因此在放射環(huán)境中處理有機(jī)物染物的細(xì)菌必須具有抗射線的能力.非致病土壤細(xì)菌耐輻射球菌Deinococcusradiodurans對(duì)高水平的放射有天然抵抗作用。這種抵抗作用歸功于其對(duì)DNA的修復(fù)能力，它對(duì)于DNA損傷的修復(fù)非常有效。而且，任何導(dǎo)入該耐輻射球菌的外源DNA，不管是以質(zhì)粒的形式還是插入到染色體上，都能抵抗高劑量的輻射。由于這種細(xì)菌能在持續(xù)放射性污染物的有毒環(huán)境中表達(dá)生物清除蛋白,因此是理想的候選細(xì)菌。圖3顯示了Deinococcusradiodurans對(duì)放射線的抵抗能力。

圖3.γ射線對(duì)大腸桿菌和耐輻射球菌的影響4.降解酶在細(xì)胞表面的表達(dá)細(xì)菌表達(dá)的降解酶一般都是在胞內(nèi)的,而細(xì)胞對(duì)某些目標(biāo)底物(特別是一些非極性物質(zhì))的攝入速率是很慢，因而降解速率也相對(duì)較慢，而利用純化的酶來催化底物降解與去毒化作用，成本則過于昂貴。因而，人們建立了一種新的方法來解決這一問題。通過對(duì)大腸桿菌的工程化處理，使有機(jī)磷水解酶在細(xì)菌外表面表達(dá)，成為含大腸桿菌脂蛋白信號(hào)肽和脂蛋白N端部分以及外膜的蛋白A的融合蛋白的一部分(圖6,7)。這樣，就可以解決細(xì)菌攝取殺蟲劑速率過慢的問題。定位于細(xì)胞膜表面的有機(jī)磷水解酶的細(xì)菌降解活性是胞內(nèi)表達(dá)相同量的7倍，而且酶活性相當(dāng)穩(wěn)定。37℃下100%活性可以保持1個(gè)月。

圖5.定位于細(xì)胞膜表面的有機(jī)磷水解酶示意圖該酶暴露于環(huán)境中并具有有機(jī)磷水解酶活性。Lpp包括大腸桿菌脂蛋白N端前9個(gè)氨基酸。OmpA包括外膜蛋白A的跨膜區(qū)（氨基酸46-159）。OPD包括產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumSPP.的有機(jī)磷水解酶基因及其信號(hào)肽。圖4.產(chǎn)生融合蛋白Lpp-OmpA-OPD的DNA構(gòu)建體構(gòu)建體含有大腸桿菌lac啟動(dòng)子，大腸桿菌脂蛋白信號(hào)肽lpp和脂蛋白N端前9個(gè)氨基酸，外膜蛋白A的跨膜區(qū)，以及產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumSPP.的有機(jī)磷水解酶基因及其信號(hào)肽。5.抗有機(jī)溶劑萃取效應(yīng)的微生物當(dāng)廢水中有機(jī)溶劑含量較高時(shí)會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞造成傷害，影響其降解能力。因?yàn)榧?xì)胞膜的主要成分是磷脂、脂蛋白和脂多糖等，而有機(jī)溶劑可以不同程度地溶解這些物質(zhì)，從而破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞失去活性。因此處理含有機(jī)溶劑廢水的微生物必須是對(duì)有機(jī)溶劑具有抗性的微生物菌種。人們?cè)缇妥⒁獾揭粋€(gè)現(xiàn)象，即發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)溶劑（如丙酮，醋酸丁脂等）的菌種對(duì)有機(jī)溶劑具有天然的抵抗力。但人們?cè)缙诓⒉恢榔渌匀?。近來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已闡明了其分子機(jī)理。

能抵抗有機(jī)溶劑萃取作用的微生物有一種酶，它可以將細(xì)胞膜中的順式脂肪酸轉(zhuǎn)變成反式脂肪酸。反式脂肪酸組成的脂類物質(zhì)具有非常穩(wěn)定的空間構(gòu)相，不易被有機(jī)溶劑破壞，但脂肪酸的生物化學(xué)性質(zhì)仍然存在，所以這種微生物在含有有機(jī)溶劑的環(huán)境中細(xì)胞膜還能保持完整的結(jié)構(gòu)。這就保證了細(xì)胞在抵抗有機(jī)溶劑的同時(shí)還具有細(xì)胞的一切生物活性。這種酶一般是組成型的，即在細(xì)胞質(zhì)中一直存在，但平