青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座

知識(shí)目標(biāo)：

掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素條件控制，及青霉素提取與精制控制點(diǎn)。重點(diǎn):掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素工藝流程難點(diǎn):青霉素提取與精制控制點(diǎn)青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第1頁(yè)什么是青霉素青霉素又被稱為青霉素G、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。青霉素是抗菌素一個(gè)，能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁（革蘭氏陽(yáng)性菌）并在細(xì)菌細(xì)胞繁殖期起殺菌作用一類抗生素，是第一個(gè)能夠治療人類疾病抗生素。青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素經(jīng)典代表。青霉素結(jié)構(gòu)青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第2頁(yè)青霉素理化性質(zhì)1、穩(wěn)定性：固體青霉素鹽穩(wěn)定性與其含水量和純度有很大關(guān)系；2、溶解度：青霉素游離酸在水中溶解度很小，易溶于有機(jī)溶劑如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其鉀鹽、鈉鹽易溶于水和甲醇，可溶于乙醇；3、降解反應(yīng)：青霉素是很不穩(wěn)定化合物，遇酸堿或加熱易分解而失去活性，并發(fā)生分子重排。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第3頁(yè)（a）最早發(fā)覺(jué)產(chǎn)生青霉素原始菌種是點(diǎn)青霉菌，生產(chǎn)能力很低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，所以被淘汰?，F(xiàn)在主要采取產(chǎn)黃青霉菌。（b）為了提升產(chǎn)黃青霉青霉素產(chǎn)量使用誘變劑如：二環(huán)氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、X射線等。菌種：青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第4頁(yè)產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum深層培養(yǎng)菌絲形態(tài)菌落：平坦或皺褶，圓形。分生孢子：鏈狀；顏色絲狀菌球狀菌黃孢子絲狀菌綠孢子絲狀菌：發(fā)酵單位85000U/mL綠孢子球狀菌白孢子球狀菌：發(fā)酵單位高，對(duì)原材料、設(shè)備要求高，提煉收率低。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第5頁(yè)青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第6頁(yè)青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第7頁(yè)青霉素發(fā)酵工藝1.發(fā)酵工藝流程青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第8頁(yè)青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第9頁(yè)孢子制備1、將沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化，得單菌落。2、再傳斜面，培養(yǎng)7天，制得斜面孢子。3、再移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，25oC，相對(duì)濕度45%-50%，生長(zhǎng)7天，大米表面長(zhǎng)出顯著小菌落時(shí)要再振搖均勻，使菌絲在大米表面能均勻生長(zhǎng)，制得綠色小米孢子。注意：①每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及檢驗(yàn)雜菌情況。②斜面孢子和米孢子培養(yǎng)要注意濕度控制青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第10頁(yè)種子罐培養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油消沫劑等；接種量:>200億孢子/t培養(yǎng)基空氣流量:1：3（通氣量與發(fā)酵液體積比）（m3/m3·min）；攪拌轉(zhuǎn)速:300-350r/min；溫度：27±1℃；時(shí)間:40h。質(zhì)量：菌絲濃度達(dá)40%，菌絲形態(tài)正常青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第11頁(yè)二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣，玉米油，消沫劑等；接種量：10％；空氣流量：1:1-1.5（m3/m3·min）；攪拌轉(zhuǎn)速：250-280r/min；pH：自然；溫度：25±1℃；時(shí)間：10-14h；質(zhì)量：菌絲濃度達(dá)40%，殘?zhí)?.0%以下，菌絲粗壯，III期（脂肪粒，積累貯藏物），無(wú)雜菌，效價(jià)在700u/ml左右。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第12頁(yè)生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第13頁(yè)培養(yǎng)基碳源青霉菌能利用多種糖，如：葡萄糖、乳糖。當(dāng)前采取淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。氮源可采取玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機(jī)氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無(wú)機(jī)氮源。前體為生物合成含有芐基基團(tuán)青霉素G，需要在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。因?yàn)樗鼈儗?duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采取屢次加入方式。無(wú)機(jī)鹽包含硫、磷、鈣、鎂、鉀（前少后多，氮源轉(zhuǎn)為氨基酸）等鹽類。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第14頁(yè)溫度控制適宜菌絲生長(zhǎng)溫度普通為27oC，分泌青霉素20℃20℃青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。變溫控制，不一樣階段不一樣溫度。生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制22℃青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第15頁(yè)pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，防止超出7.0直接加酸或堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：速度取決于pH改變快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提升通氣量pH上升：補(bǔ)加糖（補(bǔ)糖控制可依據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過(guò)程中PH值或最好是依據(jù)排氣中CO2及O2量來(lái)控制。普通在殘?zhí)墙抵?.6%左右，PH值上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖。）、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）恒速補(bǔ)糖，用酸或堿控制方式

青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第16頁(yè)溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜攪拌速度:確保氣液混合，提升溶氧青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第17頁(yè)各階段供氧比較一級(jí)種子階段二級(jí)種子階段發(fā)酵階段空氣流量（m3/m3

·min）1：31:1-1.51：0.8－1.5攪拌轉(zhuǎn)速（r/min）300-350250-280150-200青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第18頁(yè)消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。前期:主間歇攪拌,少加油中期:攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要時(shí)），策略：少許屢次，一次過(guò)多影響呼吸代謝。后期:盡可能少加消沫劑，可加水稀釋青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第19頁(yè)提煉工藝過(guò)程１．青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活２．水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定３．易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很?。矗嗝顾佧}很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物含有致敏性５．預(yù)防降解，條件溫和、快速。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第20頁(yè)預(yù)處理青霉素存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/M3含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等目標(biāo)：濃縮目標(biāo)產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液流變學(xué)特征，利于后續(xù)分離純化過(guò)程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少許絮凝劑沉淀蛋白青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第21頁(yè)過(guò)濾鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：草酸或黃血鹽一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾：硫酸調(diào)整pH4.5-5.0，加入0.07%PPB（溴代十五烷吡啶），0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0％）青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第22頁(yè)溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高有機(jī)溶劑。工業(yè)上通慣用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB(溴代十五烷吡啶)。萃?。?－3次。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第23頁(yè)逆流萃取過(guò)程正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。重復(fù)萃取2－3次，到達(dá)結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第24頁(yè)青霉素萃取方式多級(jí)逆流萃取

青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第25頁(yè)脫色1.萃取液中添加活性炭，除去色素。2.過(guò)濾，除去活性炭。青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第26頁(yè)結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。薄膜蒸發(fā)工藝圖青霉素的生產(chǎn)工藝流程專家講座第27