免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)(副本)VIP

免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)(副本)第一頁，共15頁。Westernblot

二、原理

蛋白質(zhì)(病毒、細菌蛋白)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），根據(jù)相對分子量的大小分成區(qū)帶，然后通過轉(zhuǎn)移電泳將SDS上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上加上相應(yīng)的標記抗體（如酶標抗體、膠體金標記抗體、熒光抗體、放射性同位素標記抗體），也可先加抗體反應(yīng)，再加標記的抗抗體，通過對抗體的標記物的檢測，以分析特異性抗原蛋白區(qū)帶。第二頁，共15頁。Westernblot三、基本步驟（一）目的蛋白的分離1、經(jīng)過純化的目的蛋白直接進入下一步2、未經(jīng)過純化的目的蛋白需進行分離a、SDS（根據(jù)相對分子量）b、等點聚焦電泳（根據(jù)pI）第三頁，共15頁。Westernblot

（二）轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印就是將蛋白質(zhì)由SDS凝膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上。首選的固相支撐物是硝酸纖維濾膜（NC膜）第四頁，共15頁。Westernblot

1、半干電轉(zhuǎn)印法：將凝膠和固相基質(zhì)以三明治樣夾在緩沖液浸潤的濾紙中，電轉(zhuǎn)印10-30min2、濕法電轉(zhuǎn)印法：將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間浸在轉(zhuǎn)印裝置的緩沖液中，通電轉(zhuǎn)印45min或過夜第五頁，共15頁。Westernblotting（三）免疫檢測1、NC膜的封閉為防止NC膜的非特異性背景著色，用封閉液對NC膜進行封閉。常用的封閉液為加有脫脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的緩沖液。第六頁，共15頁。Westernblotting

2、靶蛋白與特異性抗體（一抗）反應(yīng)將可識別靶蛋白的McAb或PcAb與NC膜一同溫育。3、靶蛋白與標記的二抗反應(yīng)待上步反應(yīng)結(jié)束后，洗滌NC膜，使之與標記的二抗反應(yīng)，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、膠體金等標記。第七頁，共15頁。Westernblot4、指示反應(yīng)根據(jù)標記物的不同，可采用放射自顯影、底物顯色等，在NC膜上顯示相應(yīng)的檢測蛋白帶第八頁，共15頁。Westernblot

四、Westernblot中應(yīng)該注意的問題（一）首先應(yīng)該確定檢測蛋白經(jīng)SDS和還原劑處理后，其抗原決定簇仍然可與相應(yīng)的抗體結(jié)合。特別是在用單克隆抗體作為第1抗體時應(yīng)考慮這一點。第九頁，共15頁。Westernblot

（二）要保證檢測所用抗體的特異性，尤其是一抗的特異性更為重要。另外，對一抗和標記體的使用濃度，通常要根據(jù)實際情況作適當?shù)恼{(diào)整。第十頁，共15頁。Westernblot

（三）實驗操作過程中，拿取凝膠、濾紙和NC膜的時候，必須戴手套，因為皮膚上的油脂和分泌物會阻止蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜上。第十一頁，共15頁。Westernblot

（四）轉(zhuǎn)印時要注意電流的大小，過高的電流產(chǎn)生的熱量會在凝膠和NC膜之間形成氣泡，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)印的失敗。有報道，在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入20%的甲醇，雖然降低蛋白質(zhì)的洗脫效率，但可以提高其與硝酸纖維素結(jié)合的能力?；蛘呖梢栽诰彌_液中加入終質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS,也可以提高轉(zhuǎn)印效率。第十二頁，共15頁。Westernblot

五、應(yīng)用免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)是蛋白質(zhì)組分分析和蛋白多肽相對分子質(zhì)量分析的主要方法，已廣泛用于病毒蛋白和基因表達重組蛋白多肽的