沙門氏菌檢驗詳細流程

GB4789.4-2010

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗

沙門氏菌檢驗詳細流程沙門菌概況沙門菌是1885年由Salmon氏等在豬霍亂流行時，分離出的豬霍亂沙門菌，由于Salmon氏對本屬細菌的發(fā)現(xiàn)貢獻卓越，故定名為沙門菌屬。沙門菌屬是腸桿菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原結構、生化特性相似的革蘭氏陰性桿菌。血清型繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的沙氏菌有2500多個血清型和變種。我國發(fā)現(xiàn)的有250多個血清型。沙門氏菌檢驗詳細流程沙門菌的分類根據(jù)生化反應不同，分為2個種：腸道沙門菌（Samonellaenterica）： Ⅰ腸道亞種（subsp.enterica）Ⅱ薩拉姆亞種

（subsp.salamae）Ⅲ亞利桑那亞種（subsp.arizonae）

Ⅳ豪頓亞種（subsp.houtenae）Ⅵ因迪卡亞種（subsp.indica）邦戈爾沙門菌（Samonellabongori）Ⅴ

沙門氏菌檢驗詳細流程沙門菌種和亞種的鑒別項目腸道沙門菌邦戈爾沙門菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ衛(wèi)矛醇＋＋－－－＋山梨醇＋＋＋＋－＋水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－－＋丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋－＋注：+為陽性-為陰性沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌的血清分型迄今為止沙門氏菌有57個O抗原116個H抗原Vi抗原

被分成2500多個血清型。Vi抗原O抗原H抗原沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌命名與書寫方式目前的命名方法規(guī)定：腸道沙門菌腸道亞種（亞種Ⅰ）給予專用名，并采用標本分離地址的地名。菌名的第一個字母需大寫，且亞種Ⅰ的所用菌名不能用斜體。例如：腸道沙門菌鼠傷寒血清型應書寫為Salmonellaentericasubsp.entericaserotypeTyphimurium，但在實際工作中，可簡寫為S.Typhimurium。其他沙門氏菌均不給專用名，只在亞種數(shù)字名后直接書寫抗原式，比如S.Ⅴ66:z35:-新的血清型名稱的批準必須有巴斯德研究所、德國漢堡衛(wèi)生研究所及美國CDC3個實驗室的一致同意。沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌檢驗程序沙門氏菌檢驗詳細流程目的：修復損傷的細菌細胞；方法：25g（mL）樣品＋225mLBPW的無菌均質杯中，以8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質，振蕩混勻。如使用均質袋，可直接進行培養(yǎng)。于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。前增菌沙門氏菌檢驗詳細流程無菌均質袋沙門氏菌檢驗詳細流程輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉種于10mLTTB內,于42±1℃培養(yǎng)18～24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內,于36±1℃培養(yǎng)18～24h。分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或顯色培養(yǎng)基平板）。于36±1℃分別培養(yǎng)18～24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、顯色培養(yǎng)基平板)或40h～48h(BS瓊脂平板)，觀察各個平板上生長的菌落。為了最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基。

選擇性增菌與分離沙門氏菌檢驗詳細流程分離培養(yǎng)基回收率測定（%）進口-SS65.3進口-SS81.0國產-SS52.0進口-HE83.2國產-HE80.0進口-XLD83.0國產-XLD86.2進口-BS106.6國產-BS77.7CHRO顯色68.4國產-DHL98.4國產-WS71.6TSA（對照）100.0沙門氏菌檢驗詳細流程典型菌落--BS

菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變。國產BS進口BS沙門氏菌檢驗詳細流程典型菌落--HE國產HE進口HE藍綠色或藍色,多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。沙門氏菌檢驗詳細流程典型菌落--XLD進口XLD國產XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心沙門氏菌檢驗詳細流程初篩微生物菌落顏色特異性靈敏度沙門氏菌紫色(直徑約1mm)89％100%檸檬酸桿菌屬藍色(直徑約1mm)---變形桿菌無色或被抑制---(銅綠假單胞菌也呈紫紅色，可以通過前增菌排除。所以推薦在檢測中的前增菌用TTB。粉紅色、深紅色、干燥菌落、邊緣鋸齒狀等均非沙門氏菌菌落。）沙門氏菌檢驗詳細流程生化試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板；取菌落一部分于斜面劃線后穿刺底層。接種針在接種TSI后不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。沙門氏菌檢驗詳細流程穿刺TSI方法沙門氏菌檢驗詳細流程接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,必要時可延長至48h。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復查。沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌屬的三糖鐵和賴氨酸脫羧酶試驗結果

三糖鐵瓊脂

賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

初步判斷

斜面

底層

產氣

硫化氫

-+＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

-+＋（－）

＋（－）

－可疑沙門氏菌屬

++＋（－）

＋（－）

＋可疑沙門氏菌屬

++＋/－

＋/－

－非沙門氏菌

注：＋陽性，－陰性；＋（－）多數(shù)陽性,少數(shù)陰性；＋/－陽性或陰性。

該表顯示：只有在三糖鐵斜面產酸、底層產酸；同時賴氨酸陰性的菌株可排除。其他反應結果均有沙門菌屬的可能，同時也均有不是沙門菌的可能。沙門氏菌檢驗詳細流程TSI的反應賴氨酸脫羧酶試驗沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表

反應序號

硫化氫

（H2S）

靛基質

pH7.2尿素

氰化鉀

（KCN）

賴氨酸脫羧酶

A1＋

－

－

－

＋

A2＋

＋

－

－

＋

A3－

－

－

－

＋/－

注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。

反應序號A1：為典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按下表可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。

沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表

pH7.2尿素

氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶

判

定

結

果

－

－

－

甲型副傷寒沙門氏菌(要求血清學鑒定結果)－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋沙門氏菌個別變體(要求血清學鑒定結果)注：＋表示陽性；＋表示陰性。

反應序號2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門菌靛基質陽性變體兩項結果均為陽性；反應序號3：補做ONPG，ONPG陰性，同時賴氨酸脫羧酶陽性為沙門菌；但甲型副傷寒沙門菌賴氨酸脫羧酶為陰性。沙門氏菌檢驗詳細流程沙門氏菌屬各生化群的鑒別

必要時按此表進行沙門菌生化群鑒定

項

目

ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇

＋

＋

－

－

＋

－

山梨醇＋＋＋＋＋－水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示陽性;－表示陰性。

沙門氏菌檢驗詳細流程沙門菌的其他鑒定API20EVITEK32GNI＋卡片沙門氏菌檢驗詳細流程沙門菌的血清學鑒定培養(yǎng)基：一般使用新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面作純培養(yǎng)，取斜面上部培養(yǎng)物作O抗原玻片凝集試驗，下部凝結水里的培養(yǎng)物作H抗原。H抗原的位相誘導試驗制備半固體瓊脂，融化完全分裝10ml/管，121℃滅菌15分鐘，冷至50℃?zhèn)溆谩Ｈ≌T導用血清1滴加到小平皿中，傾入冷至50℃的10ml半固體瓊脂，輕輕搖勻，凝固。將培養(yǎng)物接種到平板的中央，放入濕盒中培養(yǎng)過夜。取邊緣的菌進行H抗原的檢測。沙門氏菌檢驗詳細流程血清學鑒定時的注意要點：做血清凝集時，同時應用生理鹽水做對照。O血清不凝集時，可將菌株轉接于瓊脂量較高(如