依托昔布對大鼠單側輸尿管梗阻腎臟病變的影響

依托昔布對大鼠單側輸尿管梗阻腎臟病變的影響【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響.方法：將大鼠隨機分為單側輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對照組進行實驗，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達水平.結果：單側輸尿管結扎術后3wk，單側輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［mL/min］、尿素氮［mmol/L］和腎皮質NO含量［mmol/L］均比對照組［(±)mL/min,(±)mmol/L,mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1和COX2的表達水平顯著性上調.用藥組與單側輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達水平差異有統(tǒng)計學意義.結論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變.

【關鍵詞】輸尿管梗阻纖維化環(huán)氧化酶2依托昔布

0引言

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)包括COX1和COX2兩種同工酶，目前認為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導病理改變［1］.研究結果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現COX2在腎皮質的過度表達可能是腎內炎性細胞浸潤和聚集的起始或促進因素之一.而臨床上用非甾體類抗炎藥(nonsteroidantiinflammatorydrugs,NSAIDs)治療腎臟炎性疾病引起不良反應可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關.為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應的有效途徑［3］，我們用單側輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布(Etoricoxib)對梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對腎臟的保護作用，為治療相關腎臟損傷提供基礎.

1材料和方法

材料健康雄性SD大鼠30只，體質量180~220g，中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具.依托昔布由北京欣經科生物技術有限公司提供.山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為SantaCrutz公司產品.

方法

單側輸尿管梗阻模型動物平均分為對照組、單側輸尿管梗阻組和依托昔布治療組.對照組除不結扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組.治療組于術前24h開始給予依托昔布，每日10mg/kg溶于1mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃.g/L水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠.于背部左側縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠端結扎輸尿管，于兩結扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒.術后肌肉注射羅氏芬預防感染，每日mg/kg，連續(xù)3d.腎臟取材與保存：術后第3周，在采集血液標本后，手術取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學染色和免疫組織化學染色用.

血液生化指標測定將術后第3周采集血液標本離心，取血清，在全自動生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮.

腎皮質NO含量測定取約g左腎組織，加入4mL4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000r/min，離心5min，取上清液-20℃保存待測.用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標準管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min,4000r/min離心10min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調零，550nm,cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量，4℃冰箱過夜，復溫,PBS浸洗.滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育.PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育.PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察.以正常兔或山羊血清代替一抗作陰性對照，免疫組化結果均為陰性.

結果判定腎小管間質病變程度的判定按Priraini法評分.每例切片記錄連續(xù)不重疊的20個低倍視野的數值，取平均值.對TGFβ1和COX2的表達，根據著色范圍進行半定量分析.每例切片記錄20個連續(xù)不重疊的腎皮質間質高倍視野，取平均值.

統(tǒng)計學處理：實驗數據用x±s表示，用SPSS做統(tǒng)計分析，所用統(tǒng)計方法為方差分析，為檢驗水準.【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響.方法：將大鼠隨機分為單側輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對照組進行實驗，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達水平.結果：單側輸尿管結扎術后3wk，單側輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［mL/min］、尿素氮［mmol/L］和腎皮質NO含量［mmol/L］均比對照組［(±)mL/min,(±)mmol/L,mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1和COX2的表達水平顯著性上調.用藥組與單側輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達水平差異有統(tǒng)計學意義.結論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變.

【關鍵詞】輸尿管梗阻纖維化環(huán)氧化酶2依托昔布

0引言

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)包括COX1和COX2兩種同工酶，目前認為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導病理改變［1］.研究結果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現COX2在腎皮質的過度表達可能是腎內炎性細胞浸潤和聚集的起始或促進因素之一.而臨床上用非甾體類抗炎藥(nonsteroidantiinflammatorydrugs,NSAIDs)治療腎臟炎性疾病引起不良反應可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關.為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應的有效途徑［3］，我們用單側輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布(Etoricoxib)對梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對腎臟的保護作用，為治療相關腎臟損傷提供基礎.

1材料和方法

材料健康雄性SD大鼠30只，體質量180~220g，中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具.依托昔布由北京欣經科生物技術有限公司提供.山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為SantaCrutz公司產品.

方法

單側輸尿管梗阻模型動物平均分為對照組、單側輸尿管梗阻組和依托昔布治療組.對照組除不結扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組.治療組于術前24h開始給予依托昔布，每日10mg/kg溶于1mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃.g/L水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠.于背部左側縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠端結扎輸尿管，于兩結扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒.術后肌肉注射羅氏芬預防感染，每日mg/kg，連續(xù)3d.腎臟取材與保存：術后第3周，在采集血液標本后，手術取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學染色和免疫組織化學染色用.

血液生化指標測定將術后第3周采集血液標本離心，取血清，在全自動生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮.

腎皮質NO含量測定取約g左腎組織，加入4mL4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000r/min，離心5min，取上清液-20℃保存待測.用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標準管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30s，室溫靜置10min,4000r/min離心10min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調零，550nm,cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量，4℃冰箱過夜，復溫,PBS浸洗.滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育.PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育.PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下