實驗溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純及分子量測定演示文稿

實驗溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純度及分子量測定演示文稿當前第1頁\共有60頁\編于星期三\22點優(yōu)選實驗溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純度及分子量測定當前第2頁\共有60頁\編于星期三\22點實驗內容1.溶菌酶的粗提取2.溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定3.溶菌酶純度鑒定與分子量測定3當前第3頁\共有60頁\編于星期三\22點背景知識溶菌酶（lysozyme）：胞壁質酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。生物學效應：主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活4當前第4頁\共有60頁\編于星期三\22點5當前第5頁\共有60頁\編于星期三\22點6溶菌酶理化性質：相對分子質量14700Da，由129個氨基酸殘基構，pI:~10.8，最適溫度為50℃，最適pH為6～7左右。280nm的消光系數(shù)為13.0當前第6頁\共有60頁\編于星期三\22點7背景知識：酶的提取、分離純化初步純化（roughfractionation）（提?。喊衙笍纳锝M織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質從原料中引入溶液。

高度純化（finefractionation）（精純化）：除去與產物性質相似的雜質。純化方案評價：酶活力、蛋白濃度、純度當前第7頁\共有60頁\編于星期三\22點8

粗純化（

提取）目標：

a.將目的酶最大限度地溶解出來。

b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則a.相似相溶。b.遠離等電點的pH值，溶解度增加。當前第8頁\共有60頁\編于星期三\22點9離心分離（一）基本原理1.離心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2N/60）2

N為離心機每分鐘轉數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr

（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相對離心力與轉速之間的關系旋轉半徑用r平均代替

r平均=1/2（r大+r?。ヽm

當前第9頁\共有60頁\編于星期三\22點10

通常：低速離心以每分鐘的轉數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。當前第10頁\共有60頁\編于星期三\22點11名稱

轉速(r/min)

注意事項

低速離心機

6000

常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡

高速離心機

6000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡

超速離心機

>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡

離心機的種類

當前第11頁\共有60頁\編于星期三\22點12離心的形式角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。角式由低速到超速均有。當前第12頁\共有60頁\編于星期三\22點13角式離心機和離心頭（轉子）角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。當前第13頁\共有60頁\編于星期三\22點14離心管材質：玻璃，塑料強度：和離心速度相配大?。汉娃D子配套高速超速管要加蓋當前第14頁\共有60頁\編于星期三\22點15離心機操作平衡、定溫、定速、定時。當前第15頁\共有60頁\編于星期三\22點16實驗一、

溶菌酶的粗提取——略當前第16頁\共有60頁\編于星期三\22點17酶精純化常用技術膜分離技術柱層析技術蛋白質結晶透析超濾凝膠過濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析當前第17頁\共有60頁\編于星期三\22點18PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase當前第18頁\共有60頁\編于星期三\22點實驗二、溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定目的：1.掌握離子交換層析原理及層析操作所需的必須原件。2.掌握層析柱填裝方法及層析填料的保存3.掌握比色法測定溶菌酶的濃度與酶活19當前第19頁\共有60頁\編于星期三\22點原理：

根據(jù)溶菌酶pI10.8，pH8.0

PBS中攜帶？電，與陰/陽離子層析填料可結合，通過吸附后，提高pH或離子強度將溶菌酶與其他蛋白進行分離達到純化目的。溶菌酶對革蘭氏陽性菌細胞壁的酶解作用導致細菌完整性破壞，OD600值會下降，通過單位時間內（每分鐘）OD600值的下降評價酶活性。溶菌酶的活力單位（U）：在室溫，pH8.0的條件下，OD600每分鐘降低0.001為1個活力單位。280nm的消光系數(shù)為13.0，根據(jù)A=ECL可粗略測定溶菌酶濃度，用于酶比活的評價。20當前第20頁\共有60頁\編于星期三\22點21離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）當前第21頁\共有60頁\編于星期三\22點222.離子交換填料：離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構成。

纖維素瓊脂糖葡聚糖

載體電荷基團—O—CH2—COO-—Na+反離子1.原理:根據(jù)待分離物質帶電性質不同的分離純化方法。當前第22頁\共有60頁\編于星期三\22點23離子交換劑--帶有電荷基團的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負電的蛋白質)

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質)當前第23頁\共有60頁\編于星期三\22點24兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3當前第24頁\共有60頁\編于星期三\22點25

化學原料合成：sephadexsepharose載體

天然材料制成：cellulose

如：DEAE-Sepharose，CM-Sepharose當前第25頁\共有60頁\編于星期三\22點26

實驗設計原理利用不同的蛋白質分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。pH8.0pI>8.0蛋白質帶正電pI<8.0蛋白質帶負電溶菌酶pI:~10.8當前第26頁\共有60頁\編于星期三\22點272.陰離子交換劑分離蛋白質的過程平衡吸附去吸附分離結束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-當前第27頁\共有60頁\編于星期三\22點283.操作平衡上樣沖洗洗脫再生1）上樣：上樣體積不十分嚴格。2）洗脫:

增加溶液的離子強度

梯度洗脫法

（連續(xù)、不連續(xù)）改變溶液的pH值

3）再生：0.5-1mol/LNaCl溶液處理。4.應用制備純化生物大分子當前第28頁\共有60頁\編于星期三\22點29梯度洗脫方式當前第29頁\共有60頁\編于星期三\22點30圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度當前第30頁\共有60頁\編于星期三\22點31

層析柱的制備與層析操作

柱層析的設備:

層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。當前第31頁\共有60頁\編于星期三\22點32層析設備層析裝置：梯度混和器蠕動泵層析柱監(jiān)測儀記錄儀收集器

當前第32頁\共有60頁\編于星期三\22點33記錄儀當前第33頁\共有60頁\編于星期三\22點現(xiàn)代化層析設備

——AKTA層析柱XKBPG當前第34頁\共有60頁\編于星期三\22點實驗2.1層析柱的填裝1.觀摩2.實驗步驟1）測定酶濃度（S-2）C(mg/ml)=A280/132）若填料載量為20mg/ml，計算擬純化100mg蛋白需要的填料量和量取量。35當前第35頁\共有60頁\編于星期三\22點3）裝柱要點：a.用純水將乙醇保存液置換b.柱頭及柱底適配器確保無氣泡，可用注射器推注趕氣泡，并確保連接管路密閉無泄漏。c.填料傾倒入柱管內前先加入少量水覆蓋柱底d.柱拆卸后填料務必回收，并保存于20%乙醇中。36當前第36頁\共有60頁\編于星期三\22點二、酶的活力單位及酶活測定：1.酶活單位：1961年國際生化協(xié)會酶學委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（IU）規(guī)定為：在最適反應條件（溫度25℃）下，每分鐘內催化1微摩爾（μmol）底物轉化為產物所需的酶量（或1分鐘內轉化底物生成1微摩爾產物的酶量）稱為1標準單位。

當前第37頁\共有60頁\編于星期三\22點382.酶的比活力：

每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對固體酶：用活力單位/mg酶蛋白、或活力單位/mg酶蛋白氮來表示；對液體酶：用活力單位/ml酶液來表示。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。當前第38頁\共有60頁\編于星期三\22點分光光度法：產物與適當?shù)幕瘜W試劑生成有色物質或產物有紫外吸收的能力可采用此法。測壓法：產物中有氣體，測氣壓增加量。滴定法：產物中有酸生成，用堿滴定。熒光法：產物中有熒光物質生成或產物與熒光試劑反應生成熒光產物可用此法。旋光法：產物中有旋光物質可采用此法。

除了以上方法外，還可根據(jù)產物的性質采用其它方法。3.具體測定方法

當前第39頁\共有60頁\編于星期三\22點4.回收率和純化倍數(shù)回收率＝×100％提純后酶總活力提純前酶總活力純化倍數(shù)＝每次比活力第一次比活力當前第40頁\共有60頁\編于星期三\22點41實驗2.2溶菌酶的活性測定實驗材料：1.枯草芽孢桿菌懸液2.S1，S23.PBS等4.分光光度計、比色皿、計時器、離心機等當前第41頁\共有60頁\編于星期三\22點42實驗步驟：1.取6ml菌懸液，3500rpm*5min，棄上清，沉淀6mlPBS重懸。2.測定OD600并記錄（吸光度0.5~1.0，若讀數(shù)過高可適當稀釋）3.測定樣品準備（酶液務必在儀器等條件準備好，臨測定前加入）比色皿1234PBS緩沖液/ml5---細胞PBS懸液/ml-54.84.8酶液S1/ml--0.2酶液S2/ml0.2當前第42頁\共有60頁\編于星期三\22點43實驗步驟：4.酶活性測定，以①管（PBS）為對照，每隔30s測定2,3,4管的OD600并記錄5.酶活力及比活性計算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136.純化回收率及純化倍數(shù)計算時間（s）03060901201501802號

3號

4號

回收率＝×100％US2*V2US1*V1純化倍數(shù)＝S2比活力S1比活力當前第43頁\共有60頁\編于星期三\22點44樣品體積ml蛋白濃度mg/ml總蛋白

mg活力

u/ml比活力

u/mg總活力

U回收率%提純倍數(shù)S1V1＝

1001S2V2＝

7.完成下表當前第44頁\共有60頁\編于星期三\22點45實驗3溶菌酶的純度鑒定與分子量測定實驗目的:1、通過實驗的學習與操作，在實驗過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）測定蛋白質純度與分子量的原理與依據(jù)；2、掌握電泳原理以及SDS垂直板電泳分析蛋白質技術；3、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，SDS分子量測定圖譜的繪制與計算；4、了解在電泳中分子量標準物的使用。當前第45頁\共有60頁\編于星期三\22點46SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡稱SDS－PAGE。用于蛋白純度及蛋白質亞基相對分子量（relativemolecularmass,Mr）測定。1.原理當前第46頁\共有60頁\編于星期三\22點471.原理

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質結合后使蛋白質所帶負電荷大大超過了天然蛋白質原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質構象改變，使蛋白質－SDS復合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質分子量成正比。因此，蛋白質—SDS復合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質分子量）有關。當前第47頁\共有60頁\編于星期三\22點48

SDSseparatesproteinsbyMW當前第48頁\共有60頁\編于星期三\22點49

蛋白質的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標準曲線上求得分子量。當前第49頁\共有60頁\編于星期三\22點50當前第50頁\共有60頁\編于星期三\22點512.分離效應

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應不連續(xù)PAGE分子篩效應濃縮效應

連續(xù)PAGE當前第51頁\共有60頁\編于星期三\22點不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。電荷效應:分離膠中，蛋白質表面凈電荷不同，遷移率不同。分子篩效應：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。

當前第52頁\共有60頁\編于星期三\22點532.實驗步驟：（SDS）1）母液配制2）制膠準備:

玻璃板清洗、干燥制膠架的準備：嚴格按說明書組裝制膠架注意：輕拿輕放文明操作，避免玻璃板破損制膠架松動及其他設施偏離工作要求。當前第53頁\共有60頁\編于星期三\22點542.實驗步驟：（SDS）3）制膠:

分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇15%的分離膠，如表配制當前第54頁\共有60頁\編于星期三\22點55濃縮膠（10ml）雙蒸水0.5mol/LpH6.8Tris-HCl30%膠貯液10%SDSTEMED10%AP5%3.4ml0.63ml0.83ml50μl5μl50μl分離膠（20ml）雙蒸水1.5mol/LpH8.8Tris-HCl膠貯液10%SDSTEMED10%AP12%3.3ml2.8ml2.5ml2.0ml4ml5ml100μl4μl100μl當前第55頁\共有60頁\編于星期三\22點563、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。4、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連