微生物限度檢驗培養(yǎng)基質量控制

微生物限度檢驗培養(yǎng)基質量控制第一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六概念細菌的生長繁殖需要一定的營養(yǎng)條件，為獲取能力并維持其生長繁殖，細菌必須從外界吸取某些物質，包括水分、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。不同種類的細菌對營養(yǎng)的要求也不同。第二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六概念培養(yǎng)基具有適合細菌生長需要的各種營養(yǎng)物質，包括微生物生長所需要的水分、碳源、氮源、無機鹽及某些生長因子（維生素、輔酶）等。除此以外，還具備待培養(yǎng)菌適宜生長的酸堿度。培養(yǎng)基是人工配制的微生物生活環(huán)境第三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六分類主要用于增菌用于檢測動力及保存菌種用于分離鑒定細菌第四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六分類雙糖鐵培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基第五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六概念由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、瓊脂、膽鹽等成分的質量及酸堿度不同等，影響了培養(yǎng)基質量的穩(wěn)定性。適宜的培養(yǎng)基制備方法、儲存條件和質量控制是提高優(yōu)質培養(yǎng)基的保證第六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六主要內容培養(yǎng)基購置、貯存、制備、使用注意事項培養(yǎng)基質量控制常用菌株保存方法第七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六一、培養(yǎng)基購置、貯存、制備、使用注意事項第八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六

購置依據ISO/IEC17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，對培養(yǎng)基的供應企業(yè)進行評價后選擇合格的供應商；應選擇產品市場信譽度高、有質量保證能力和服務保證能力的企業(yè)；要求生產企業(yè)提供：培養(yǎng)基成分名稱及產品編號、批號、使用前的pH、儲藏信息和有效期、性能評價和所用測試菌株、技術數據清單、質控證書以及必要的安全/危害數據等材料。第九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六驗收購買的培養(yǎng)基到貨后，應有專人做好接受和驗收工作，應仔細核對生產企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱、規(guī)格數量、外觀特征、批號、保質期是否符合要求。每批培養(yǎng)基到貨物后都應對培養(yǎng)基的質量進行檢測，滿足檢測方法規(guī)定的要求后方可投入使用。

第十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的儲存干粉培養(yǎng)基應保存在陰涼干燥處，要避免陽光直射；未開瓶的培養(yǎng)基在室溫下的最長保存2年，開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕，應注意防潮并在6個月內用完。應定期對儲存中的培養(yǎng)基進行常規(guī)檢查，如容器密閉性復查、首次開封日期、內容物的感官檢查，如果培養(yǎng)基發(fā)生結塊、顏色異常和其他變質跡象就不能再使用。

第十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備

制備培養(yǎng)基用容器不得為銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長。所有容器在使用前都要根據不同的情況，經過一定的處理，洗刷干凈。有的還要進行包裝，經過滅菌等準備就緒后，才能使用。容器的大小需大于復水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出。

第十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基制備用水中不能含有任何抑制或影響微生物生長的物質。使用蒸餾水或與其同質的水。最好不使用離子交換器生產的去離子水。

第十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備

每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄復制復制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，復制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。第十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱取完畢后，即移放于右側。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的

第十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備

在培養(yǎng)基分裝滅菌前，各成分應溶解均勻。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現有焦化現象、該培養(yǎng)基即不能使用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。第十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的制備因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質量。一般滅菌前比最終pH高0.2-0.3。用1mol/LNa0H或lmol/LHCL調整。

第十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的滅菌

已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，避免微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，還會使瓊脂的凝膠強度下降，因此必須嚴格控制滅菌溫度和時間，并且不可重復滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學變色紙片對滅菌效果進行驗證。

第十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的滅菌

滅菌以后培養(yǎng)基應該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內，造成過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現有菌生長，即棄去。第十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的儲存培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱放置時間一般不宜超過一周。傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。如果保存時間超過2天，應將其放入密封的塑料袋中保存。配好的肉湯類培養(yǎng)基如果保存時間超過2周，應將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發(fā)第二十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基的使用平板在接種使用時，表面必須無明顯潮濕水珠。對于冰箱保存的平板，應待溫度回復至室溫后再使用用于沉降菌檢測的所有平板必須經無菌試驗后才可使用固體培養(yǎng)基滅菌后再融化只允許一次。第二十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基質量控制第二十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六由于不同批次的蛋白胨、浸膏（粉）、瓊脂、膽鹽等成分的質量及酸堿度不同等，影響了培養(yǎng)基質量的穩(wěn)定性。因此對購入的干培養(yǎng)基開展質量檢驗驗收是實驗室室內質量控制的重要內容之一。第二十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六現有培養(yǎng)基質控標準WS/T2322003商業(yè)性微生物培養(yǎng)基質量檢定規(guī)程衛(wèi)生部衛(wèi)監(jiān)發(fā)（1993）7號文件食品衛(wèi)生微生物檢驗用干燥培養(yǎng)基生產質控和質量標準第二十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六質控參數1.外觀：干粉色澤、研細度。2.溶解后培養(yǎng)基色澤、透明度、雜質、沉淀物、硬度（凝膠強度）；3.滅菌后pH值；4.菌落形態(tài)、菌落大?。ㄖ睆剑?；5.生長率第二十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六計數培養(yǎng)基判斷結果干粉色澤均勻、研細度好，色澤符合要求制備好的培養(yǎng)基有相應的顏色，一般的培養(yǎng)基應澄清、無渾濁、無沉淀。pH值符合、硬度適宜，劃線不破、透明無沉淀物。菌落大小、形態(tài)與對照培養(yǎng)基一致。第二十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六選擇性培養(yǎng)基判斷結果檢查項目：

促生長能力抑制能力指示能力第二十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六事例13批4號培養(yǎng)基質量控制第二十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六編號生產廠家批號1××市微生物培養(yǎng)基廠0801242×××試劑有限公司0803153×市疾病預防控制中心20070821生長率試驗對照瓊脂為：哥倫比亞瓊脂，由法國生物-梅里埃公司提供，有效期至20100404第二十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六質控采用菌株生長率試驗：O1群霍亂弧菌小川型、O1群霍亂弧菌稻葉型、O139群霍亂弧菌雜菌抑制試驗：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌。第三十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六

培養(yǎng)基質控參數

PH值

霍亂弧菌生長率

雜菌抑制能力

菌落典型性第三十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六

結果（一）PH值：受試培養(yǎng)基均在要求范圍內雜菌抑制能力：采用的4株測試菌株肉湯混和物在四號平板上均無生長。第三十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基編號O139小川稻葉1+/--+2

+-+3+++/-+

四號瓊脂上菌落大于對照瓊脂

-

四號瓊脂上菌落小于對照瓊脂

+/-

四號瓊脂上菌落與對照瓊脂上相當

稀釋菌液推皿后，置于37℃培養(yǎng)24h，作菌落計數，并觀察菌落生長情況。1、所有受試四號瓊脂平板菌落的亞碲酸鉀還原良好。2、四號瓊脂上菌落生長情況結果(二)第三十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六編號O139生長率（%）小川生長率（%）稻葉生長率（%）195.286.693.6292.884.195.3394.690.892.5

四號瓊脂上菌落數生長率=------------------------------×100%

對照瓊脂上菌落數

生長率計算結果:第三十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六結論3批培養(yǎng)基均為合格產品。第三十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六事例26批SS培養(yǎng)基質量控制第三十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)基理化指標pH值色澤硬度透明度17.10正常（橙紅）適宜、劃線不破透明、無不溶物26.70偏紅適宜、劃線不破透明、無不溶物36.90偏紅適宜、劃線不破透明、無不溶物47.20正常（橙紅）適宜、劃線不破透明、無不溶物56.80偏紅適宜、劃線不破透明、無不溶物66.60紫紅適宜、劃線不破透明、無不溶物對照7.20正常適宜、劃線不破透明、無不溶物pH值、色澤、硬度、透明度、沉淀物結果第三十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六pH值、色澤、硬度、透明度、沉淀物檢測結果1、硬度、透明度、沉淀物6批培養(yǎng)基均符合要求2、pH值除1號、4號符合要求外，其他培養(yǎng)基均偏低，尤其是6號更是低至6.603、凝固后的瓊脂色澤符合性與pH值相同。第三十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六24h菌落形態(tài)培養(yǎng)基鴨沙門菌ATCC50083鼠傷寒沙門菌ATCC50013傷寒沙門菌ATCC50097腸炎沙門菌分離株大腸埃希菌ATCC25922形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小1無適中H2S適中無適中H2S適中挑紅適中2H2S適中無較小無適中無較小挑紅適中3H2S適中無較小無適中H2S較小挑紅適中4H2S較大H2S適中無適中H2S適中挑紅適中5無較大無

適中無適中無適中挑紅適中6無適中無

適中無較小無適中挑紅適中對照正常適中正常適中正常適中正常適中正常適中第三十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六36h菌落形態(tài)

培養(yǎng)基鴨沙門菌ATCC50083鼠傷寒沙門菌ATCC50013傷寒沙門菌ATCC50097腸炎沙門菌分離株大腸埃希菌ATCC25922形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小1H2S適中H2S適中H2S適中H2S適中挑紅適中2H2S適中無較小無適中H2S較小挑紅適中3H2S適中H2S適中H2S適中H2S較小挑紅適中4H2S較大H2S適中無適中H2S適中挑紅適中5H2S較大無

適中無適中H2S適中挑紅適中6無適中無

適中無較小H2S較小挑紅適中對照正常適中正常適中正常適中正常適中正常適中第四十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六48h菌落形態(tài)培養(yǎng)基鴨沙門菌ATCC50083鼠傷寒沙菌ATCC50013傷寒沙門菌ATCC50097腸炎沙門菌分離株大腸埃希菌ATCC25922形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小形態(tài)大小1H2S適中H2S適中H2S適中H2S適中挑紅適中2H2S適中無較小無較小H2S適中挑紅適中3H2S適中H2S適中H2S較小H2S適中挑紅適中4H2S較大H2S適中無適中H2S適中挑紅適中5H2S較大無

適中無適中H2S適中挑紅適中6H2S適中無

適中H2S較小H2S較小挑紅適中對照正常適中正常適中正常適中正常適中正常適中第四十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六菌落形態(tài)結果1號、4號培養(yǎng)基菌落形成H2S速度較快,大小也適中。5號、6號、3號培養(yǎng)基菌落大小適中,但形成H2S速度較慢。2號、3號培養(yǎng)基部分菌落偏小，形成H2S速度較慢。H2S形成時間：24h與36h差異明顯。36h與42h差異不明顯。第四十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六菌落直徑和生長率檢測結果培養(yǎng)基大腸埃希菌ATCC25922鼠傷寒沙門菌ATCC50013志賀菌ATCC51573傷寒沙門菌ATCC50097直徑

(mm)生長率(%)直徑(mm)生長率(%)直徑(mm)生長率(%)直徑(mm)生長率(%)12.5048.402..69103.952.4258.331.8871.8622.7011.762.2063.842.2341.671.8098.2032.7013.072.6070.062.3039.581.7073.6542.6031.702.78110.172.4862.501.82104.7052.6213.732.6080.792.4052.081.80111.3862.701.312.6097.742.3233.3331.80100.00對照2.90100.002.80100.002.60100.002.20100.00

第四十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六項目1號2號3號4號5號6號外觀符合符合符合符合符合符合pH值符合7.10偏低6.70偏低6.90符合7.20偏低6.80過低6.60色澤符合偏紅偏紅符合偏紅過紅硬度、沉淀物符合符合符合符合符合符合菌落形態(tài)典型H2S遲、菌落小H2S遲、菌落小典型H2S偏遲H2S偏遲大腸菌菌落直徑2.50mm2.70mm2.70mm2.60mm2.62mm2.70mm生長率48.40%11.76%13.07%31.70%13.73%1.31%沙門菌菌落直徑2.69mm2.20mm2.60mm2.78mm2.60mm2.60mm生長率103.95%63.84%70.06110.1780.7997.74志賀菌菌落直徑2.42mm2.23mm2.23mm2.48mm2.40mm2.40mm生長率58.3341.6739.5862.50%52.0833.33%結論合格不合格不合格合格基本合格基本合格第四十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六常見培養(yǎng)基干粉外觀要求.doc常見培養(yǎng)基典型菌落形態(tài).doc增菌類培養(yǎng)基的質量要求.doc第四十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六常用菌株保存方法第四十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六質控菌株要求標準菌株：來自國際/國家菌種保藏中心(本標準要求為ATCC菌株)或經ISO9002認證的經銷商提供的菌株(有資質)制備儲備菌株和工作菌株時一次制備多份，每株菌原則上不能重復使用通常工作菌株不能再傳代，但處理得當可再次使用第四十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六標準儲備菌株(Referencestock)標準菌株在實驗室經過一次傳代獲得的一組完全相同的菌株傳代菌株應當完全具備標準菌株的所有性狀傳代時要保證一定的量(減少傳代次數)每株菌株盡量避免多次使用采用不同的保存方法保存期限不同如凍干法,液氮法,穿刺法,液體石蠟法,斜面保存法等(見后)第四十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六菌種保藏方法斜面冰箱保藏法液體石蠟封藏法半固體保存法液氮保存法低溫保存法冷凍真空干燥保藏法第四十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡便，實驗室均采用。缺點：移接代數太多，易產生變異、退化。第五十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六液體石蠟封藏法在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細菌和放線菌。石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。第五十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六半固體保存法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)培養(yǎng)結束后，無菌操作在層流臺下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于2-8℃冰箱中或室溫下保存。此法制備簡單，不需要其他特殊設備一般無芽胞細菌也可保藏1年左右缺點是保存時必須直立放置，不便攜帶；取培養(yǎng)物接種時，當接種環(huán)在火焰上灼烷時容易飛濺第五十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六液氮保存法保存制備細胞懸液，甘油或二甲亞砜作保護劑分裝無菌安瓿瓶，每管0.2ml預凍至-40℃（控制溫度下降速率為1℃／min）放入液氮生物貯存罐中氣相保存恢復直接浸入38℃水浴中解凍5～10min轉接于適宜培養(yǎng)基內培養(yǎng)注意：大多數屬種適于慢速凍結和快速解凍第五十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六適用菌種病毒支原體各類細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌藍藻動物細胞

第五十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期六液體石蠟覆蓋保存法傳代保存的變相方法能夠適當地延長保存時間優(yōu)質石蠟121℃高壓滅菌2h，160℃干燥箱中滅菌1-2h，放冷備用液體石蠟的深度以1cm左右保存期通常6個月至一