修改版三黃雞NLRP3基因組織表達(dá)和分布的研

（NLRP3作為最重要的炎性體傳感器之一，對調(diào)節(jié)炎性體活化，避免造成過度激活，有著顯著的作用。三黃雞是華南地區(qū)最重要的優(yōu)質(zhì)肉雞品種，也是綜合防控壓力極大雞品種之一。但是，到目前為止，還沒有NLRP3在雞的組織特NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用的不利因素。本研究對三黃雞NLRP3進(jìn)行了克隆和序列分析通過重組原核表達(dá)純化蛋白出多克隆抗體分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化分析研究三黃雞各個(gè)組織中NLRP3的mRNA相對表達(dá)水平及NLRP3NLRP3在雞炎癥性疾病中的作用和為進(jìn)一步NLRP3在不同物種的功能和進(jìn)化提供了基礎(chǔ)，4部分內(nèi)1、三黃雞NLRP3克隆及序列分運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增了三黃雞NLRP3并將其克隆到pMD18-T載體中進(jìn)序?qū)Λ@得的序列提交到GenBank，獲得accessionno：KF318520。NLRP3編碼734個(gè)氨基酸蛋白分子量為82.7KDa通過MegAlign軟件對不同物種的NLRP3序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，三黃雞NLRP3基因與牛、羊、豬、狨、人、獼猴、小鼠和大鼠的同源性分別為54.2%、53.9%、53.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%，該哺乳類動(dòng)物間的同源性52%。2、實(shí)時(shí)熒光定量分析三黃雞NLRP3的表擴(kuò)增的目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分別在253bp和167bp處有一條相應(yīng)的特異性條帶，其大小與理論推測相符。NLRP3在三黃雞所檢測的所有組織中均有表達(dá)。NLRP3在三黃雞的肺臟和氣管中的表達(dá)量大大高于其它通過雙酶切和序列測定證明成功構(gòu)建了pET32a(+)-NLRP3表達(dá)質(zhì)粒。NLRP3His重組融合蛋白得到有效表達(dá)通過SDS蛋白凝膠電泳檢測純化蛋白條帶大小約為100KDa，與其預(yù)測的大小相一致用His抗體和自己的純化IgG分別進(jìn)行Westernblot4NLRP3利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對NLRP3蛋白在三黃雞各個(gè)組織的分布進(jìn)行研究。結(jié)果表明，三黃雞NLRP3蛋白在檢測組織的陽性染色細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有不同程度的表達(dá)和分布。NLRP3蛋白在心臟和脾臟呈現(xiàn)弱陽性至中強(qiáng)陽性反應(yīng)，但是在 皮細(xì)胞呈中至強(qiáng)陽性，腎小球和腎小球囊細(xì)胞 theStudyofTissue-specificExpressionPatternandDistributionofNLRP3in YellowChicken(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthernAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,):Pathogen-associatedmolecularpatterns(PAMPs)yimportantrolein tionwhichmeansresponseofthehosttostimuli.NOD-likereceptorprotein3(NLRP3)infl someisinvolvedintheonsetanddevelopmentofinfl NLRP3,asoneofthemostimportantinfl somesensors,hassignificanteffectontheregulationofinfl someactivationtoavoidtheconsequencesofoveractivation.yellowchickenisthemostimportantqualitybroilerbreedinSouth,whichisofthegreatpressureofcomprehensivepreventionandcontrol avianinfluenza.However,uptodate,therearenodetailedtissuespecificexpressionanddistributiondataaboutNLPR3inchicken,whichisthenegativefactorforfurtherresearchonthetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesinavian torydiseases.Here,NLRP3ofyellowchickenwasclonedandsequenceyzed,thepolyclonalantibodywasproducedbypurifiedproteinofbinantprokaryoticexpression.RelativeexpressionlevelsandtissuedistributionofNLRP3wereinvestigatedbyreal-timetativePCRandimmunohistochemicalysis,respectively.TheresultswillhelptoelucidatetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesininfl torydiseasesofchickenandprovideabasisforfurtherinvestigationsinthefunctionandevolutionofNLRP3indifferentspecies,whichwouldbehelpfulforfurtherresearchonavian torydiseases.TherearepartsofthisAmplificationofyellowchickenNLRP3geneandsequenceysisyellowchickenNLRP3genewasamplifiedbyRT-PCRandthesequencewasdepositedinGenBank(accessionno.:KF318520),whichyzedwithbioinformaticssoftwares.Theresultsshowedthatthededucedproteinisconsistsof734aminoacidsanditsdeducedmolecularweightis82.7KDa.ThenucleotidesequencesofNLRP3werealignedusingthesoftwareMegAlign(DNAstar,Madison,WI).ThenucleotidehomologyofNLRP3amongyellowchickenandBostaurus,Hainanblackgoat,Susscrofa,Callithrixjacchus,Homosapiens,mulatta,MusmusculusandRattusnorvegicuswere54.2%,53.9%,53.755.4%,54.3%,54.5%,53.5%,53.7%.TheNLRP3geneisconservativeinmlianbutsignificantlydifferentbetweenmlianandchicken,withonly52%homology.Real-TimetativePCRysisofyellowchickenNLRP3Melting-curveprofileysisconfirmedthespecificityofprimersforamplificationofNLRP3andβ-actinfragments.Theamplifiedtargetgenefragmentsof253and167bp,respectively,wereevaluatedbyagarosegelelectrophoresisandwereinaccordancewithexpectations.Thesequencesofthesetwotargetgenefragmentsshowed100%homologywiththeoriginalsequences.NLRP3expressedinallchickentissuesexamined.TherelativeexpressionlevelofNLRP3inthetracheaandlungwereverysignificantlyhigherthanthatinothertissuesexamined(P<0.01).TherewasnosignificantdifferenceofNLRP3expressionlevelsbetweentheheart,liver,spleen,kidneyandbursaofFabricius.ProkaryoticexpressionofyellowchickenNLRP3andthepreparationofthepolyclonalantibodyDoubleenzymedigestionandnucleotidesequenceysisshowedthat binantHis-taggedNLRP3wasefficientlyexpressedandSDSshowedthatthepurifiedproteinbandwasconsistentwiththepredictedsize,whichisapproximay100KDa.WesternblotdetectionusingHis-tagantibodyandourpreparedIgGshowedthatthefusionproteinwastheHis-taggedNLPR3.ImmunohistochemicalysisofyellowchickenThemethodofimmunohistochemistrywasestablishedtodetecttissuespecificdistributionofyellowchickenNLRP3.ImmunohistochemicaldetectionshowedthatchickenNLRP3wastissuespecificdistributionandlocatesincytosmofthepositivestainingcells.Thecytosmexhibitedweaktomediumpositivestainingintheheartandspleen,butstronginthetrachea,lung,brain,liver,bursaofFabricius,andkidney.Ciliatedepithelialcells,basalcellsandcellsinlaminapropriaandsubmucosaoftracheastainedstrongpositive,whilecellsincricoidcartilageshowednegative.ThealveolarepithelialcellsofthepulmonaryalveoliwerestronglypositiveforNLRP3proteinexpressioninthelung.Cardiacmuscleexhibitedweaktomoderatestaining,whilethatoftheconnectivetissueswasnegative.Inthecerebralcortexofthebrain,someareasofthematrixexhibitedweakpositiveandneuronsshowedmediumtostrongpositivestaining.Inspleen,theendothelialreticularcellsexhibitedweaktomediumpositivestainingwhilelymphocyteshowednegative.InbursaofFabricius,lymphocytesofmedullainstannousfollicleshowedstrongwhilecortexcellsshowedfocalstrongpositive.Interestingly,mucosalepithelialcellsofbursaofFabriciusshowedmediumtostrongpositive.Inliver,partoflivercellsexhibitedmediumtostrongpositivestaining.Inkidney,mostoftherenaltubularepithelialcellsexhibitedmediumtostronglypositivestainingwhilethecellsintheglomerulusandBowman’scapsuleswerenegative. 前 1.1性炎癥的發(fā)生及其機(jī) NLRP蛋白及其在炎癥反應(yīng)中的作 NLRP蛋白NLRP3炎性復(fù)合體的組成及其在炎癥反應(yīng)中作 NLRP3的分子結(jié)構(gòu)及其分布情 NLRP3炎性復(fù)合體參與機(jī)體炎癥的途徑及其機(jī) NLRP3炎性復(fù)合體參與流感炎癥的途徑及其作 本研究的目的和意 材料與方 材 實(shí)驗(yàn)動(dòng) 抗 主要試劑盒及試 主要溶液的配 RNA提取用試劑的配 瓊脂糖電泳用試劑的配 大腸桿菌感受態(tài)的及轉(zhuǎn)化用溶液的配 免疫組化相關(guān)溶液的配 主要儀器設(shè) 分析工具軟 方 三黃雞NLRP3的克隆與鑒 三黃雞總RNA的提 引物的設(shè)計(jì)與合 cDNA的合 PCR擴(kuò)增三黃雞NLRP3PCR產(chǎn)物的回 感受態(tài)細(xì)胞（JM109）的（氯化鈣法 pMD18-T載體的連接反 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn) 陽性質(zhì)粒菌落和質(zhì)粒PCR鑒 質(zhì)粒雙酶切鑒 重組質(zhì)粒的序列測定及分 三黃雞NLRP3熒光定量實(shí) 三黃雞NLRP3的原核表達(dá)與多抗的三黃雞NLRP3的組織學(xué)分 免疫組化的實(shí)驗(yàn)步 免疫組化結(jié)果的判 結(jié)果與分 三黃雞NLRP3的克隆與質(zhì)粒的鑒 三黃雞NLRP3的序列分 三黃雞熒光定量實(shí)驗(yàn)NLRP3和β-actin的鑒 熒光定量實(shí)驗(yàn)溶解曲 熒光定量PCR擴(kuò)增曲 標(biāo)準(zhǔn)曲 三黃雞NLRP3的原核表達(dá)與多抗原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié) 三黃雞NLRP3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純 重組蛋白的純 三黃雞NLRP3蛋白多克隆抗體的三黃雞NLRP3的組織學(xué)分 討論與結(jié) 參考文 附錄 附錄 1.1性炎癥的發(fā)生及其機(jī)反應(yīng)恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)為移除有害刺激或病原體及促進(jìn)損傷免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，既能感受各種病原或相關(guān)相關(guān)分子模式，又這兩個(gè)免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除的病原微生物固有免疫系統(tǒng)也稱為天然免疫系(patternrecognitionreceptors,PRRs)廣泛識(shí)別和結(jié)合存在于病原體上的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)和宿主自身的相御反應(yīng)。固有免疫是機(jī)體的第一道防線可對環(huán)境中的微生物及理化損傷做出反應(yīng),維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。NLRP3炎性復(fù)合體被激活后，促進(jìn)IL-1β前體和IL-18前體的成熟和IL-β、IL-18的分泌。IL-1β、IL-18等方面有積極作用。I-1β和I-18會(huì)通過細(xì)胞表面上的受體作用于巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)某些趨化因子和粘附分子的表達(dá)，募集和激活中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞。如果過量表達(dá)則會(huì)過度的炎癥反應(yīng)還可以通過-kB誘導(dǎo)多種促損傷的酶類合成，增加細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（Bonatal.,199；Hagbergetl.,199；Lebel-Binayetal.,200），從而對細(xì)胞和組織產(chǎn)生損傷作用。機(jī)體后，首先引起的是免疫系統(tǒng)這種免疫反應(yīng)天然存在機(jī)體不是針對某一種異體物質(zhì)（包括微生物，而是針對一切的異體物質(zhì)。這包括部位的屏擾素和K細(xì)胞（自然細(xì)胞）等，在侵入和早期時(shí)，對防止入侵、殺滅和清除，起著主要的免疫作用。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種可激活NLRP3炎性復(fù)合體，引起機(jī)體的炎性反應(yīng)NLRP3炎性復(fù)合體可感應(yīng)識(shí)別RNA如流感（Kannegantietal.2006）、腦心肌炎（EMCV（Rajanetal.2011）、西尼羅（Byrneetal.,2001）、呼吸道合胞（RSV）（Takeuchietal.,1998）、丙（HCV）（Burdetteetal.,2012）、麻疹（Measles）（Komuneetal.,2011）等，也可感應(yīng)識(shí)別DNA，如腺（Allenetal.,2009）、水痘帶狀皰疹（Barlanetal.,2011）、皰疹（HSV）（Sergerieetal.,2007）、乙和釋放，引起炎癥反應(yīng)。多種和不同的成分可激活caspase-1，而IL-1β和IL-18又在對的免疫應(yīng)答中起了重要的作用（Rathinametal.,2010）。同存在的形式。NLRP3炎性復(fù)合體抑制的機(jī)制主要有以下幾種：直接2010；Xiangetal.,1999）。NLRP蛋白作為宿主抵抗病原體的第一道防線固有免疫通過模式識(shí)別受pattern-recogitinrecetorsPRs來識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmoleclarattrns，MPs)，活下游信號(hào)通路，機(jī)體的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答。模式識(shí)別受體從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體方面可分為以下三類:視黃酸誘導(dǎo)I樣的受體(RIG-IlikerecetorsRLsoll樣體(olllierecetorTLs)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotidebindingolgomerizatin，O)樣受體ND-likereceptos，NRs)，這些受體可被細(xì)菌和病-κBIFN；Kaaietal.,2009））NOD樣受體（NODlikereceptors,NLRs）是一個(gè)近年在炎癥反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的胞漿蛋白，是固有免疫系統(tǒng)對病原體的一類重要感受器，感受來自病原體上的病原相關(guān)分子模式（pathogen-asssociatedmolecularpatterns,AMPs，也可以感知內(nèi)源性信號(hào)相關(guān)分子模式（danger-associatedmolecularpatterns,DAMPs），并且與其它蛋白共同組裝成多分子信號(hào)復(fù)合物炎癥小體 some)，活化半朧氨酸蛋白酶(caspase)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放，炎癥反應(yīng)（Akiraetal.,2006；Takeuchietal.,2010）。NLRs包括5個(gè)NOD成員，14個(gè)NLRP（NLRfamily,pyrincontaining 稱為NACHT-LRR-PYD-containing proteins，NALP)，以及IPAF(theIL-1β）CII（classtransactivaterNAIP（NeuronalApoptosisInhibitorProtein）（Petrillietal.,2007）。NLR成員包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和NLRP6。NLRP蛋白作為NLRs狀細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等（Vialaetal.,2004）。NLRP32002年Martinon等（Martinonetal.,2002）提出具有核苷酸結(jié)合寡聚化區(qū)域，它”（Morietal.2011；Schertzeretal.2011）。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的炎性復(fù)合體是NLRP1炎性復(fù)合體。隨著復(fù)合體等（Schroderetal.,2010）。NR3（nucleoide-inding oiomerization leucinerich repetscontaiingyrin3）炎性復(fù)合體是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白聚合物，是目前研究最詳盡的炎性體，其主要由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（NLRP3、由P胱天蛋白酶募集域(caspase recruiment CRD) 構(gòu)成的酸溶性膠原蛋白 (AS) 、pro-casase-1蛋白等3部分組成（Martinonetal,2002）。AC是細(xì)胞內(nèi)一類重要的銜接蛋白，N端為PYD結(jié)構(gòu)域，C端是CRD結(jié)構(gòu)域，其作用是連接N蛋白及caspase-前（Joostenetal.,211Caspase-1是一種分子量為5Kd的無活性酶原，通過形成的炎癥小體被剪切成為成20Kd及10K的活性形式結(jié)構(gòu)活性casase-1剪切細(xì)胞介素-1（IL-1和白細(xì)胞介素-18（I-8）的前體使之成為成形式結(jié)構(gòu)（Joostenetal.,2011）。I-β是一種重要的細(xì)胞因子在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用IL-1β分子量31Kd的無活性前體形式結(jié)構(gòu)于細(xì)胞漿中通過caspas-1剪切成為成分子量為17K的成熟形式來發(fā)揮作用（Turneretal,2014）。I-1β可誘導(dǎo)白細(xì)胞向受損傷組織進(jìn)行浸潤引起發(fā)熱促進(jìn)造血及血管內(nèi)膜再生多種細(xì)胞增殖（Naiketal.,201）。作為免疫炎性反應(yīng)的“感受器”和“調(diào)節(jié)器，NRP3炎性復(fù)合體能夠識(shí)別外源性和內(nèi)源性信號(hào)通過LRNLRP3與其配體MD結(jié)合后使原來處于自我抑制無活性狀態(tài)的NR3發(fā)生構(gòu)象變化出了NCHT結(jié)構(gòu)域然后通過三磷酸腺（T的聚合而形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚體，接著募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosi-associated speck-like protein，AC)及半胱天冬酶(caspase)形成復(fù)雜的復(fù)合物——炎性復(fù)合體(ifl some)（Bouchier-Hayesetal.2001），pro-caspase-1變?yōu)橛写呋钚缘腸aspase-1，催化IL-1β的前體pro-IL-1β變?yōu)槌蒊L-1β，1β18al.2003PYDCARD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成ASCPYD結(jié)構(gòu)域與NLRP3中的PYDCARD結(jié)構(gòu)域則通過同類型結(jié)構(gòu)募集caspase-1的CARD結(jié)構(gòu)域（Bouchier-Hayesetal.,2001；Tingetal.,2005）。到目前為止，上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)（Chenetal.,2011）。 PYDs-containingprotein3)，又名NALP3CLR1.1CryopyrinCIAS1PYPAF1NLR(NODlikereceptor)險(xiǎn)信號(hào)的細(xì)胞質(zhì)識(shí)別受（Satohetal.,2013其端是一個(gè)約20個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)(leuie—richrepatLRR)結(jié)構(gòu)域其以構(gòu)架形式供蛋白與糖脂之間蛋白與蛋白之間以及病原體或微生物之間的相互作用在識(shí)別和感應(yīng)病原相關(guān)分子模式(AMP)上發(fā)揮重要作用。中間部分是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 (nucleotid—bindingndoligoerizationD／NCH)為NRs各成員共有的特征性結(jié)構(gòu)域。NACHT結(jié)構(gòu)域在激活過程中介導(dǎo)NRP3分子的自身寡聚化其與凋亡蛋白激酶活化因子的核苷酸結(jié)合區(qū)具有同源性蛋白端是效應(yīng)結(jié)構(gòu)域即熱蛋白結(jié)構(gòu)域(P)主要分布在細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞膜中具有將NRP3受體分子與下游銜接蛋白銜接起來的作用（Bryantetal.,2009；Takahashi,011還可以和AC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合調(diào)節(jié)caspas-的激活（Agostinietl.,204）。NR3的表達(dá)細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和一些初級(jí)免疫細(xì)胞。、、能夠感應(yīng)和識(shí)別包括細(xì)菌真菌及其毒素和抗體如細(xì)胞壁成分、微生物的DNA、RNA等多種病原體（Dostertetal.,2009；Hafner-Bratkovicetal.,小顆粒等非病原體來源刺激物（Dostertetal.,2008；Halleetal.,2008），與此同萄糖等信號(hào)也會(huì)刺激其活化，參與免疫炎性反應(yīng)（Baueretal.,2012；Brozetal.,2010）。、、性的pro-IL-1β前體和激活信號(hào)路徑即控制著無活性的pro-IL-1β向有生物學(xué)活性的成熟IL-1β的成熟過程2個(gè)信號(hào)路徑（Grossetal.,2011）。免疫細(xì)胞天然表達(dá)的內(nèi)源性NLRP3水平還不能夠到達(dá)炎性復(fù)合體的激活水平從而產(chǎn)生caspase-1（Bauernfeindetal.,2009），而預(yù)激信號(hào)路徑可以提高NLRP3的產(chǎn)生pro-IL-1β。因此，預(yù)激信號(hào)路徑在免疫細(xì)一是NLRP3激活物誘生活性氧，而活性氧再介導(dǎo)NLRP3成為活化多聚體。而活性氧抑制劑可以阻斷IL-1β和IL-18的生成，這些相關(guān)研究也從另外一個(gè)角度闡述了該機(jī)制（Cruzetal.,2007；Sekiyamaetal.,2005）。二是溶酶體裂解蛋NLRP3（Halleetal.2008Hornungetal.,2008）。NLRP3有自我調(diào)節(jié)的作用正常情況下處于非激活狀態(tài)但當(dāng)存在NLRP3活化劑時(shí)，它可寡聚化募集ASC，繼而活化caspase-1。到目前為止，NLRP3炎性復(fù)合體的激活主要有3種機(jī)制，即ATP依賴的鉀離子外流，溶酶體的溶解以及活性氧的形成。第一個(gè)機(jī)制是ATP依賴的鉀離子外流。病原體、損傷壞死細(xì)胞和相關(guān)配體等釋放ATP結(jié)合細(xì)胞膜表面的門控離子通道P2X7嘌呤受體，導(dǎo)致鉀離子快速外流，細(xì)胞膜孔上的銜接P2X7嘌呤受體的pannexin-1通道逐漸開放。胞外的NLRP3激活劑小分子配體可通過pannexin-1孔隙進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)從而激活NLRP3炎性復(fù)合體（Kahlenbergetal.,2004；Kannegantietal.,2007）。第二個(gè)機(jī)噬細(xì)胞溶酶體隨之裂解，并釋放出溶酶體蛋白酶類(組織蛋白酶B)至胞質(zhì)后，繼而激活NLRP3炎性復(fù)合體（Gasseetal.,2009；Yinetal.,2013）。因此，通過抑制溶酶體蛋白酶類活性的方式即可有效防止炎性體的活化（Hornungetal.,2008）。第三個(gè)機(jī)制是活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的形成。大部分生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的增加，促使硫氧還 TRX）的解離，然后TXNIP與NLRP3相結(jié)合，隨之激活炎癥小體（Lee,2011；Zhouetal.2010）。研究表明，ROSNLRP3炎癥小體。ROS（Casseletal.,2008；Dostertetal.,2008；Fukumotoetal.,2013）。到目前為止研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感能通過激活NLRP3炎性復(fù)合體引起免疫炎性反應(yīng)，NLRP3炎性復(fù)合體在發(fā)生過程中具有非常重要的作用。早在2009年，Thomas等（Thomasetal.,2009）就發(fā)現(xiàn)流感RNA組可激活NLRP3炎性復(fù)合體。而在流感過程中，NLRP3炎性復(fù)合體就參與到性免疫應(yīng)答（Ichinoheetal.,2009）。有研究表明，流感質(zhì)子可通過胞內(nèi)M2炎性復(fù)合體的活化，從而細(xì)胞因子IL-1β的分泌，最終導(dǎo)致免疫炎性反應(yīng)（McAuleyetal.,2013）。有研究，構(gòu)成NLRP3炎性復(fù)合體主要結(jié)構(gòu)的NLRP3、ASC和Caspase-1中一個(gè)或者多個(gè)結(jié)構(gòu)缺陷或者被敲除的小鼠在流感病毒時(shí)支氣管肺泡液和中IL-1β和IL-18水平明顯下降肺部的清除能力受到一定程度的損害，呼吸道炎癥明顯減輕而率顯著提高（Allenetal.,2009；Ichinoheetal.,2009；Kannegantietal.,2006；Thomasetal.,2009）。NLRP3的研究主要集中在哺乳類動(dòng)物，如人和小鼠。三黃雞是華南地區(qū)最重要的優(yōu)質(zhì)肉雞品種，也是綜合防控壓力極大雞品種之一。NLRP3在雞的組織特異性表達(dá)和分布的詳細(xì)數(shù)據(jù)。NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用的不利因素。本研究對三黃雞NLRP3進(jìn)行了克隆和序列分析，通過重組原核表達(dá)純化蛋白出多克隆抗體，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化分析研究三黃雞NLRP3mRNANLRP3蛋白的組織分布。研究結(jié)NLRP3在雞炎癥性疾病中的作用和為進(jìn)一步試驗(yàn)所用三黃雞為60日齡，購自華南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心辣根酶標(biāo)記抗兔IgG，購自中杉金橋生物技術(shù)HIS單克隆抗體，購自鼎國生物技術(shù)TotalRNA提取試劑購自寶生物工程（大連）Code:D312RNAisoReagent PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit購自寶生物工程（大連）有 Code:D6110APrimeScript200RnasedNTPMixture（10mMOligodTRandom6RnaseTaKaRaExTaq購自寶生物工程（大連）Code:DRR001ATaKaRaExTaq(5U/uL) 1TaKaRaLATaq購自寶生物工程（大連）CodeNo.:RR02MATaKaRaLATaq(5U/μl) 25μL10×LAPCRBufferII(Mg2+ 1dNTPMixture(各2.5 400pMD18-TVector購自寶生物工程（大連）Code:D101ApMD18-TVector(50ng/uL) 20μL×1支Control Ligation DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）Code:DR-IDR-II28Rinse80ElutionSpin50Collection50質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒購自寶生物工程（大連）CodeSolution15Solution15Solution2428Rinse80ElutionSpin50Collection50SYBR?PremixExTaqTM(PerfectReal 200（大連）DNAMarker100購自寶生物工程（大連）DNAMarker15000購自寶生物工程（大連）DAB試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)Code：ZLI-9017(12)中性樹膠(顯微光學(xué)用)購自標(biāo)本模型廠產(chǎn)品IPTG購自寶生物工程（大連）（EB自鼎國生物技術(shù)。RNA20min。⑵75%無水乙 0.1%DEPC ⑴10mg/mL溴化乙錠（EB）100mgEB10mL 冰乙 0.5MEDTA（pH 100mL50大腸桿菌感受態(tài)的及轉(zhuǎn)化用溶液的配⑴氨芐青霉素(AMP)液：將1g氨芐青霉素溶于10mL去離子水中，終濃度100mg/mL，用0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝成1mL，-20℃?zhèn)溆胓al20mgX-20mg/mL-LB胰蛋白 酵母提取 20min。LB15g12150℃以下時(shí)，倒制平板。如要加入抗生素如氨芐青霉素（Amp)卡那霉Amp/LB/X-gal/IPTG在澆制好的Amp/LB平板上加入40uLX-gal(20mg/mL)以及20uLIPTG(200mg/mL)37℃溫育至液體完全吸⑴10%福爾固定1000mL。⑵0.02MPBS(pH1000mLNaCl8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO40.4g0.01M檸檬酸緩沖液(pH1000mL水中加檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g超速離心機(jī)：TGL-16H，醫(yī)學(xué)儀器；冷凍臺(tái)式離心機(jī)：TGL-16R，醫(yī)學(xué)儀器PCR擴(kuò)增儀：PTC1148，BIO-RAD公司熒光定量PCR儀：Bio-RadiQ5opticlesystem，BIO-RAD公司；Gilson公司、芬蘭大龍公司；凝膠透射分析儀：UV-3B，醫(yī)學(xué)儀器；超低溫冰箱：925，ThermoForma，；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101-1-BS，躍進(jìn)醫(yī)療器械廠單人單面凈化工作臺(tái)：SW-CJ-IFD，蘇州凈化設(shè)備，中國蘇州；電子天平：JM2102，余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備；便攜式pH計(jì)：PHB-3，三信儀表廠，中國數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-1，常州澳華儀器。研缽，缽棒，藥匙，錫箔紙，各種玻璃耗材均購自廣州叢源儀器。全自動(dòng)脫水機(jī)：TP1020Leica，德國；烘片機(jī)：HI1220Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：RM2145Leica光學(xué)顯微鏡：XSP-2C光學(xué)儀器五廠，中國；生物組織包埋機(jī)：BM-V孝感市電子儀器廠，中國孝感；電熱恒溫水浴鍋：KWS寧波自動(dòng)化儀表廠，中國浙江；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101-1-BS躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國；顯微照相設(shè)備：Axioskop2plusZEISS，德國；PCR引物設(shè)計(jì)軟件：Primer5.0DNA序列數(shù)據(jù)庫：NCBI/Genbank/nucleotide保守結(jié)構(gòu)域分析：NCBI/Conserveds三黃雞NLRP3的克隆與鑒RNA試驗(yàn)用品的預(yù)處理：研缽及缽棒，藥匙洗凈后，用錫箔紙包裹，2006小時(shí)；塑料制品用0.1%的DEPC水溶液浸泡過夜后牛皮紙包裹，高高壓滅菌，37TrizolReagent⑴將已速凍的三黃雞組織迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用缽棒快速研100mg組織粉末加入到1mLRNAisoReagent5min。⑵加入200μl氯仿蓋緊離心管蓋用力震蕩待充分溶液呈乳白狀后，5min后，4℃12,000×g15min。⑶從離心機(jī)中取出離心管，此時(shí)液體分為三層，即：無色的上清液，10min。4℃，12000g10min⑸棄去上清緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇1mL洗滌RNA沉淀4℃12,000g離心5min；棄去乙醇RNA保存于-80℃。參照GenBank登錄的原雞NLRP3設(shè)計(jì)特異性引物，用以擴(kuò)增NLRP3，引物均由寶生物工程大連有限公司合成，上游引物為：5'-AGCACGCCATGGCGATGGCAGGAGAAGAAA-3'，下游引物為：-cDNAPrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit0.2mLPCR管中配制下列混合液：TotalOlidodT10mMdNTPDEPCPCR PCR上述變性，退火后反應(yīng) RNase 5×PrimerScript DEPC PCR 1uLcDNAcDNAPCR擴(kuò)增，其余小量分PCRNLRP3依據(jù)TaKaRa提供的引物合成說明書，用超純水稀釋引物至終濃度20pmol/uL。稀釋之前用低速離心機(jī)離心數(shù)秒，稀釋操作過程中要操作，避TaKaRaLATaqPCRPCRPCRdNTPTaKaRaLA10×LATaqPCR 35PCRPCRDNADNA1.5mLEp管中，稱量凝膠重量并計(jì)算凝膠體積（1mg=1μL的比例進(jìn)行計(jì)算）。4DR-IBuffer，65℃6～10min，并于其間輕搖幾次EPDR-IBuffer1/2DR-IIBufferSpinColumnCollectionTubeSpinColumn內(nèi)，12000rpm1min，棄濾液。500μLRinseASpinColumn12000rpm30s700μLRinseBSpinColumn12000rpm30s⑻將SpinColumnEP30μL去離子水洗脫DNA12000rpm1min1μL感受態(tài)細(xì)胞（JM109）的（氯化鈣法-80℃40μl在瓊脂平板上復(fù)蘇，37℃37℃2-3mLLB培養(yǎng)基，用滅菌的牙簽挑取LB37℃搖床培養(yǎng)過夜。⑷取前一天搖的菌液100μl于新的滅菌10mLLB中，放到37℃搖，2h100mL250mL3min，4℃7000prm10min，棄上清。3mL0.1mol/LCaCl2輕輕吸打懸浮菌體，然后兩管并為一管，4℃7000rpm離心，10min，棄上清。1mLCaCl215%100μl1.5mLEp管中，-80℃pMD18-T0.2mLPCRPCR回收產(chǎn)物

ab滅菌雙蒸 cLigation 50-100μL5-10μLPCR連接產(chǎn)物，30min。42℃45-60s2minAmp/LB/X-gal/IPTG平板上，待菌液被平板吸收后，將37℃溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。PCR鑒定PCR鑒定:10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 滅菌雙蒸 分別用滅菌牙簽挑選若干白斑，在反應(yīng)體系中捻動(dòng)數(shù)次，棄掉牙簽，蓋好PCRPCR 30more PCR3mL(100μg/mL)LB培養(yǎng)基中，37℃250μLSolutionI(含RNaseA1)，充分懸浮細(xì)菌沉淀。250μLSolutionII5～6次使其混勻，讓菌體充400μL4℃SolutionIII5～6次使其混勻，直2min，12000rpm10min，取上清。SpinColumnCollectionTubeSpinColumn12000rpm1min，棄濾液。SpinColumn40μLDNA1min，12000rpm1min，回收⑾取1μL質(zhì)粒DNAPCR1：50PCR擴(kuò)增，反25uL如下：10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 稀釋質(zhì) 滅菌雙蒸 PCR 30more 1μLPCR取三黃雞的PCR鑒定陽性質(zhì)粒pMD18-T-C-NLRP3NcoⅠXhoⅠ雙酶切20μL體系中進(jìn)行，包括：10×K將提取的重組質(zhì)粒送至寶生物工程(大連)公司，序列正確的三黃雞pMD18-T-C-NLRP3。用DNAMAN6.0、DNAStar7.0軟件對不同物種的NLRP3序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；用DNAMAN6.0構(gòu)建NLRP3系統(tǒng)進(jìn)化樹；用ProtParamTool()分析氨基酸組成、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；用SignalP4.1Server()分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽；用ProtScale()分析蛋白質(zhì)的疏水性；用Conserveds工具，分析三黃雞NLRP3保守區(qū)結(jié)構(gòu)域；用TMpred()分析預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜三黃雞NLRP3熒光定量實(shí)根據(jù)Genbank中三黃雞NLRP3(登錄號(hào)為KF318520)設(shè)計(jì)1對特異性R1,253bpR2連)合成。:–-PCR擴(kuò)增三黃雞8個(gè)組織的NLRP3熒光片RNA、反轉(zhuǎn)錄成PCR反應(yīng)體系。分別以三黃雞各個(gè)組織cDNA為模板，NLRP3熒光片段PCR反應(yīng)體系NLRP3熒光片段PCR反應(yīng)體10×ExTaq dNTP Forward Reverse TaKaRaEx NLRP3熒光片段的PCR反應(yīng)條件 35 2%PCRPCR擴(kuò)增三黃雞8個(gè)組織的β-actin熒光片分別以三黃雞各個(gè)組織cDNA為模板，β-actin熒光片段的PCR反應(yīng)體β-actinPCR反應(yīng)體10×ExTaq dNTP Forward Reverse TaKaRaEx β-actin的PCR反應(yīng)條件 2%PCRPCR，重組質(zhì)粒正確后利用1ug/ul的重組質(zhì)粒模板作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高PCR擴(kuò)增。PCRSYBR?PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 重組質(zhì) PCRPCRSYBR?PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 與β-actin實(shí)驗(yàn)程序均為Stage30StageStageABIreal-timeRT-PCR7500systemsoftware軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，SPSS20.0P值檢（1）PCRNLRP3ORF10×ExTaqdNTPTaKaRaExPCR 35moretimes 2min30s PCRPCR(2)PCRPET32α（+）載體的連接、、。PET32α（+）-NLRP3PCR、0。PET32α（+）-NLRP3的雙酶切鑒定10×K重組質(zhì)粒及分PCR和雙酶切鑒定都為陽性的重組質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司，命名為PET32α（+）-NLRP3。NLRP3將鑒定后的陽性重組質(zhì)粒PET32α（+）-NLRP3重新轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,并均勻涂布于含Amp的LB平板上，溫箱培養(yǎng)過夜。同時(shí)設(shè)置LB/Amp的液體培養(yǎng)基中，37°C搖床4~6OD600達(dá)到0.8~1.0時(shí)，留取部分菌液保種。1mMIPTG37°C5h1mL10min，4°C12000rpm10min50μL0.2MTris-Cl（pH8.0）50μL的2×SDS100°C10min12000rmp5min，10uL上樣，同時(shí)設(shè)立蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量對照。80V120V，染色當(dāng)電泳結(jié)束后取下凝膠，用不低于5倍體積的考馬斯亮蘭，4hWesternBlottingSDS結(jié)束后，取出墊-濾紙-PVDF膜-濾紙-纖維墊的順序，裝入轉(zhuǎn)印夾中。PVDF膜側(cè)接正極，4°C200mA2h。PVDFS5～10min。用鉛筆標(biāo)出作為分子量的用TBST對PVDF膜進(jìn)行脫色，直至紅色條件下孵育過夜）加入HIS單克隆抗體（1:1000），搖室溫孵育1h（或2～8°C條件TBST35min加入稀釋的辣根酶標(biāo)記抗兔IgG（1:5000），搖室溫孵育30min。TBST35min。檢測將PVDF膜置于TanonFineDoX6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)的暗箱中，將稀釋好的HPR化學(xué)發(fā)光試劑加至PVDF膜上，經(jīng)一定時(shí)間，在電腦屏幕三黃雞NLRP3NLRP31L4h的細(xì)菌培養(yǎng)物置于預(yù)先稱重的離心管中，4℃5000g棄上清，稱沉淀的重量，每克(濕重)5mLPBS緩沖液，輕輕懸動(dòng)，12000g10PBS2×SDS凝5min，12000rpm3minSDS電泳后用蒸餾水反復(fù)凝膠3遍再用PBS3遍用4℃預(yù)冷的0.25mol/LKCl30sPBS3次，4℃靜置過夜。次日4000g離心，201mg/mL。NLRP3蛋白多克隆抗體的。動(dòng)物免疫將上述純化的蛋白(濃度約1mg/mL)與弗氏完全佐劑混合后500μg/500μL純化的重組蛋白，加入等量的弗氏完全佐劑，并用兩個(gè)注射器和膠管成乳白色乳劑后免疫新西蘭兔劑的鑒定：將。脈少量采血，經(jīng)ELISA和瓊擴(kuò)檢測抗體效價(jià)，合格后即可采血。50mL滅菌離心管收集箱中過夜，取出后4000r/min離心10min。將轉(zhuǎn)移到新的潔凈的離心管中，5630minNaN30.02%，分裝后-80℃保存。（8三黃雞NLRP3的組織學(xué)分1cm，放入10％中爾固定48h以上。10h⑶梯度(70%：5h；80%：4h；90%：3h；95%：2h；100%I：20min；100%II：20min)脫水。二甲苯(I：25minII：25min)透明。⑷561.5h4μm42°C12h90%、80%、70%各3min，蒸餾水2min)。3%H2O2(甲醇:H2O29:1)10min0.02MPBS5min×30.02MPBS5min×31:200PBS替代一抗作為空白對照，371.5h0.02MPBS5min×31:4000IgG，371h0.02MPBS5min×3DAB顯色：DAB5min0.02MPBS5min×41:101min10min⒅梯度脫水(70%、80%、90%、95%各3min，無水乙醇I5min，無水II5minI10minII10min)。無棕黃色顆粒的判為5%的判為弱陽性；明亮的棕黃色顆粒在組織中零星分布且比例大于50%或片狀染色的的判為三黃雞NLRP3的克隆與質(zhì)粒的鑒的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條單一的條帶，其大小與預(yù)測的NLRP3的理論大小相符。將目的片段克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli三黃雞NLRP3的PCR鑒定和雙酶切鑒定結(jié)果（圖3.1。重組質(zhì)粒pMD18-T-C-NLRP3經(jīng)分析結(jié)果正確，并將序列上傳到NCBI上，序列號(hào)為圖3.1三黃雞NLRP3的PCR鑒定、雙酶切鑒定結(jié)重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物三黃雞NLRP3的序列分將三黃雞NLRP3與牛（ ）、羊（KM236558）、 進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)三黃雞NLRP353.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%（圖3.2）。用DNAMAN構(gòu)建NLRP3系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示該哺乳類動(dòng)物間的同源性高，雞和哺乳類動(dòng)52%（3.3）。ProParamNLRP3蛋白的理化性質(zhì)分5.62。ProtScale對其的疏水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該蛋白最大的疏水指數(shù)位于第Server對其信號(hào)肽預(yù)測分析表明該蛋白不存在信號(hào)肽（3.5）。sPYD結(jié)構(gòu)域、NACHT結(jié)構(gòu)域、LRR結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白（3.6）TMpred軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白存（loop1（3.7）圖3.2NLRP3的同源性比圖3.3NLRP3的系統(tǒng)進(jìn)化3.4NLRP33.5NLRP33.6NLRP33.7NLRP3三黃雞熒光定量實(shí)驗(yàn)NLRP3和β-actin的鑒相應(yīng)的特異性條帶，其大小與理論推測相符（3.8←β-圖3.8用于熒光定量三黃雞 和β-actinPCR結(jié)果SyberGreenIreal-timePCR時(shí)，判斷產(chǎn)物反應(yīng)特SyberGreenI分PCRSyberGreenI結(jié)合。3.93.10NLRP3基圖3.10三黃雞β-actin的熒光定量實(shí)驗(yàn)的溶解曲PCRNLRP3和β-actin的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線分別如圖3.11和圖3.12所示。兩個(gè)的擴(kuò)增曲線均分為三個(gè)時(shí)期：基數(shù)期、指數(shù)期和平臺(tái)期。在基數(shù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。在指數(shù)擴(kuò)增期，PCR產(chǎn)物量的 圖3.11三黃雞NLRP3的熒光定量PCR擴(kuò)增曲圖3.12三黃雞β-actin的熒光定量PCR擴(kuò)增曲將NLRP3和β-actin的重組質(zhì)粒作為模板，模板稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，將未知的待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品置于同一實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行熒光定量PCR，用PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始3.133.14所示。NLRP3的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-2.758973x+29.080881(R2=0.999497)此標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2>0.99。β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-2.758807x+22.635201(R2=0.999815)R2>0.99。圖3.13三黃雞NLRP3的標(biāo)準(zhǔn)曲圖3.14三黃雞β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲NLRP3在各個(gè)組織的相對表達(dá)水NLRP3在三黃雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、氣管、法囊組織中均有表達(dá)。NLRP3在三黃雞的肺臟和氣管中表達(dá)量明顯高于其它表3.1NLRP3在各個(gè)組織的相對表達(dá)水組 NLRP3相對表達(dá)水平（心 肝 脾 肺 腎 大 氣 法氏 圖3.15三黃雞NLRP3在各個(gè)組織的相對表達(dá)水PCR擴(kuò)增獲得NLRP3片斷，將片段與PET32α(+)載體同時(shí)分別進(jìn)行挑取陽性菌落做質(zhì)粒PCR3.162205bp3.16PET32α(+)-NLRP3PCR（M：DL5000DNAMarker；1：PCR；2PET32α(+)-NLRP3NLRP3將陽性BL21(DE3)IPTG濃度為1mM的LB培養(yǎng)基度37°CWB檢測，得到單一條帶，且大小與目的條帶一致（3.17,3.18）3.17PET32α(+)-NLRP3蛋白圖3.18His單克隆抗體檢測NLRP3的表3.19,3.20。3.19SDS3.20WB三黃雞NLRP3蛋白多克隆抗體的將好的抗體用WB方法檢測，圖3.21結(jié)果顯示：所的抗體能與抗 的抗特異性較好。圖3.21抗特異性檢檢測結(jié)果表明：三黃雞NLRP3蛋白在檢測組織的陽性染色細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有不同程度的表達(dá)和分布。NLRP3蛋白在心臟和脾臟呈現(xiàn)弱陽性至中強(qiáng)陽性呈（圖3.22A）。肺泡上皮細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)（圖3.22B）。心肌細(xì)胞呈部分基質(zhì)呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)，神經(jīng)元細(xì)胞則呈現(xiàn)中至強(qiáng)陽性反應(yīng)（3.22D）。在脾臟內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽性至中強(qiáng)陽性反應(yīng)而淋巴細(xì)胞呈圖3.22E）反應(yīng)。法氏囊黏膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)中至強(qiáng)陽性反應(yīng)（3.22F）。在肝臟，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)中至強(qiáng)陽性反應(yīng)（3.22G）。在腎臟，大多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)中至強(qiáng)陽性反應(yīng)，而腎小球和腎小球囊細(xì)胞呈（圖3.22H）。氣管纖毛上皮細(xì)胞，基底細(xì)胞，固有層和粘膜下層細(xì)胞呈強(qiáng)陽性，環(huán)狀軟骨細(xì)胞呈Scanbar=50μm肺泡上皮細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)。Scanbar=50μmC心肌細(xì)胞呈弱陽性至中強(qiáng)陽性，心肌間結(jié)締組織呈。Scanbar=50μm大腦皮層部分基質(zhì)呈弱陽性，神經(jīng)元細(xì)胞呈中至強(qiáng)陽性。Scanbar=50μm脾臟內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞呈弱陽性至中強(qiáng)陽性，淋巴細(xì)胞呈。Scanbar=50μmScanbar=50μmGScanbar=50μmH大多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞呈中至強(qiáng)陽性，腎小球和腎小球囊細(xì)胞呈。Scanbar=50μm圖3.22NLRP3在三黃雞的檢測組織內(nèi)分布的免疫組織化學(xué)檢炎性復(fù)合體在感受來自病原微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)和受損或細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(damageassociatedmolecularpatternsDAMPS)，包括微生物配體，細(xì)胞因子和活性氧簇，就會(huì)被重新組裝而激活，從而參與到機(jī)體性免疫應(yīng)答之中（Elinavetal.,種各樣的炎癥性疾?。⊿trowigetal.2012）。作為最重要的感受器之一，NLRP3（Burdetteetal.2012；Pontilloetal.2012；Pontilloetal.2012；Shietal.,2012）。NLRP3蛋白的組織表達(dá)形式可以有助于闡明其在雞炎癥性疾病過程中NLRP3在雞的組織特異性表達(dá)和分布的詳細(xì)數(shù)據(jù)，NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用的進(jìn)一步研究。本研究對三黃雞NLRP3進(jìn)行了克隆和序列分析比對。結(jié)果顯示，該基通過對雞IL-1β序列進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)了IL-1β在哺乳類動(dòng)物和禽類之制。我們關(guān)于雞NLRP3與其他物種同源性的分析結(jié)果，將會(huì)為哺乳類和禽不受caspase-1約束的細(xì)胞凋亡通路等，有著廣泛和密切的聯(lián)系（Anandetal.,2011；Pothlichetetal.,2013；Sutterwalaetal.,2014；Zhangetal.,2012）。本試驗(yàn)所的雞NLRP3多克隆抗體有助于對NLRP3炎性復(fù)合體誘導(dǎo)的信號(hào)通路實(shí)時(shí)熒光定量和免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果分別顯示了NLRP3和蛋白在三黃雞組織中的表達(dá)情況。NLRP3mRNA在三黃雞所檢測的所有組織中均有表NLRP3mRNA，新城疫等的主要發(fā)病場所，其對宿主有著重要的影響作用（Villegas,1998）。由于的，IL-1β表達(dá)量發(fā)生了改變，這證明NLRP3炎性復(fù)合體得到了激活（Yuetal.,2014）。NLRP3蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析Mansson（Manssonetal.,2011）NALP3mRNA和蛋白存在于鼻息肉和正常的上呼我們之前關(guān)于NLRP3蛋白在BALB/c小鼠組織中分布情況的是相一致的（Huangetal.,2014）。由于法氏囊是禽類相比于哺乳類動(dòng)物所特有的免疫，在病原體對雞的中扮演著重要的角色，因此，NLRP3可能是這個(gè)發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要分子。之前也有報(bào)告顯示，NLRP3蛋白可以在人類的主要免疫細(xì)胞中被檢測出來（Kummeretal.,2007）。這些結(jié)果表明，NLRP3在炎癥反應(yīng)中的作用是具有位點(diǎn)專一性的。BALB/c小鼠NLRP3蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，只有極少量的肝細(xì)胞呈現(xiàn)中至強(qiáng)陽性反應(yīng)（Huangetal.,2014），NLRP3蛋白表達(dá)結(jié)果中，則有相當(dāng)大部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)中這些結(jié)果說明，NLRP3組織分布的不同可以因此推斷出生物物種的不同。NLRP3對于調(diào)控炎性復(fù)合體激活以避免過度活化所造成的不良結(jié)果具有非NLRP3的研究主要集中在哺乳類動(dòng)物，如人和小鼠。三黃雞是華南地區(qū)最重要的優(yōu)質(zhì)肉雞品種也是綜合防控壓力極大雞NLRP3在雞的組織特異性表達(dá)和分布的NLRP3在禽類炎癥性疾病中作用的不利因素。本研究對三黃雞NLRP3進(jìn)行了克隆和序列分析，通過重組原核表達(dá)純化蛋白出多克隆抗體，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)NLRP3mRNANLRP3蛋白的組織分布。研究結(jié)果顯示，三黃雞NLRP3與牛、羊、豬、狨、人、獼猴、小53.7%。該在哺乳類動(dòng)物間的同源性高，在雞和哺乳類動(dòng)物間的同源性低，僅有52%。NLRP3mRNA在所有檢測的組織中均有表達(dá)，且在氣管和肺中的表果表明，雞NLRP3克隆及序列分析，組織特異性表達(dá)和分布將有助于闡明 兩年時(shí)間以來對我耐心的指導(dǎo)和無微不至的。盡管只是兩年時(shí)間的相處，但勤勤懇懇，踏踏實(shí)實(shí)工作的行為卻已經(jīng)深深地了我。作為導(dǎo)師，寧老師以自己的實(shí)際行動(dòng)為我們這些樹立了一個(gè)值得學(xué)習(xí)和敬佩的榜樣寧老師是一個(gè)的老師，也是一個(gè)嚴(yán)格要求的導(dǎo)師。對于學(xué)術(shù)之外的事情，寧老師對我們格外寬容，可以，但是只要涉及到人品、學(xué)術(shù)道德和學(xué)術(shù)態(tài)度，他對我們這些卻是異常的嚴(yán)厲，不容許有一點(diǎn)的不端和隨便的行為。寧老師鉆研實(shí)驗(yàn)。兩年時(shí)間轉(zhuǎn)瞬即逝，我也即將離開以寧老師為的病理教研室，但是，寧老師在做人和做事方面對我的教育會(huì)一直影響著我的一生。在即程中給予的和幫助。醫(yī)解剖組胚教研室葉亞瓊師姐、梁美樂、張麗華同學(xué)，在實(shí)驗(yàn)和寫作過程中過以及過我的所有老師、同學(xué)以及已畢業(yè)的師兄師姐。在畢業(yè)之際，我還要感謝我的家人。感謝他們在我兩年的階段，始終包容著我的，支持著我的決定，在物質(zhì)上和精神上給予我無微不至的關(guān)在即將完成之際，再一次向所有關(guān)心、幫助、支持我的親人、老師、同南表示最衷心的感謝!AgostiniL,MartinonF,BurnsK,etal..NALP3formsanIL-1beta-processinginflsomewithincreasedactivityinMuckle-Wellsautoinfltorydisorder[J].Immunity,AkiraS,UematsuS,TakeuchiO.Pathogenrecognitionandinnateimmunity[J].Cell,AllenIC,ScullMA,MooreCB,etal..TheNLRP3inflsomemediatesinvivoinnateimmunitytoinfluenzaa 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