蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的概念和意義蛋白質(zhì)設(shè)計的分類蛋白質(zhì)設(shè)計的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)分子設(shè)計的流程蛋白質(zhì)分子設(shè)計思路本節(jié)小結(jié)第一節(jié)概述蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計的概念和意義1、概念實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子改造目標的一整套方法、計劃、措施和指導(dǎo)方針。以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)模型和結(jié)構(gòu)預(yù)測等方法，構(gòu)建具有新功能的蛋白質(zhì)模型的技術(shù)。如何理解？分子設(shè)計包括：目標、思想、程序、方法、措施、驗證和分析一系列過程。是藍圖—如：建筑工程的設(shè)計藍圖—宏偉構(gòu)思和誘人的前景是理論—理論上的設(shè)計——指導(dǎo)實踐過程是實踐—實踐上的驗證——提出問題與建筑工程的藍圖不同——實施驗收(也有豆腐渣工程——不是設(shè)計的問題)是設(shè)計—實踐—驗證—再設(shè)計—再實踐—再驗證的過程是一個設(shè)計—驗證反復(fù)進行的過程。獲得新功能蛋白質(zhì)分子及其分子模型2、意義：（通過分子設(shè)計、人工改造蛋白）理論上：解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系實踐上：滿足生產(chǎn)實踐的需求蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的核心問題與前沿領(lǐng)域是一門新興的研究領(lǐng)域，是眾多學(xué)科的交叉結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)等隨其他學(xué)科的發(fā)展而不斷地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷地更新。設(shè)計和實踐成功的實例：DNA結(jié)合蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、氧化還原活性蛋白理論上：解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系？為什么組成天然蛋白質(zhì)只20種氨基酸， 卻具有高度多樣性，功能如此廣泛又各不相同？？蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系？？蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系？？蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系？2、意義——理論上：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計天然蛋白的缺陷生物進化過程中，自然選擇了數(shù)量眾多、種類各異的天然蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)在特定的條件下應(yīng)用，(適合于生物環(huán)境)改造蛋白的優(yōu)勢工業(yè)生產(chǎn)—高溫高壓條件，其結(jié)構(gòu)和功能改變，達不到理想的效果。 為了更好地發(fā)揮蛋白質(zhì)的作用，需要對蛋白質(zhì)進行人為改造。如：藥物、食品工業(yè)和污水處理中的酶、疫苗、生物傳感器等進行蛋白分子設(shè)計改造，發(fā)揮良好的作用。如：經(jīng)改造穩(wěn)定性好的酶，可從價格便宜的棕櫚油中生產(chǎn)出價格昂貴的可可脂，創(chuàng)造很高的經(jīng)濟效益。2、意義——實踐上：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計如：荷蘭一家公司設(shè)計了一種與漂白劑一同起作用的去污酶（對酶上兩個氨基酸修改，使這種酶具有較高抵抗力），在洗滌過程中不受破壞。如：醫(yī)學(xué)上，蛋白質(zhì)工程也具有廣泛的應(yīng)用前景。比如，用人工手段去改造蛋白質(zhì)，開辟了診斷和治療癌癥的新途徑。 單鏈抗體—核素——免疫影像？ 單鏈抗體—毒素——免疫治療？我國的蛋白質(zhì)工程達到國際先進水平，如：重組人胰島素和溶血栓藥物、重組人尿激酶等。對這些蛋白質(zhì)改造離不開蛋白質(zhì)分子設(shè)計。因此，蛋白質(zhì)分子設(shè)計在生產(chǎn)實踐中具有重要意義蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計

二、蛋白質(zhì)設(shè)計的分類包括兩種分類方式1、根據(jù)對蛋白質(zhì)改造的程度分為三類第一類為“小改”，即通過定位突變或化學(xué)修飾來實現(xiàn)；第二類為“中改”，即不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝，改變蛋白質(zhì)的功能特性的方法；——如：蛋白質(zhì)融合技術(shù)實現(xiàn)第三類為“大改”，即全新設(shè)計具有特定功能的蛋白質(zhì)——仿生2、根據(jù)改造對象分為兩類基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計全新蛋白質(zhì)的分子設(shè)計3、兩種分類方法是統(tǒng)一的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計

三、蛋白質(zhì)設(shè)計的基礎(chǔ)理解（一級結(jié)構(gòu)—高級結(jié)構(gòu)—功能的關(guān)系）——蛋白質(zhì)分子設(shè)計的基礎(chǔ)理解結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)——蛋白質(zhì)獨特的性質(zhì)和功能是其特定結(jié)構(gòu)的反映。1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)（理解2點）每一種天然蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，決定于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點20種aa各具特殊的側(cè)鏈，側(cè)鏈基團的理化性質(zhì)和空間排布各不相同，可形成多種多樣的空間結(jié)構(gòu)，具有不同生物學(xué)活性。一級結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)功能和活性存在差異，甚至完全不同。每種蛋白質(zhì)具有特定的結(jié)構(gòu)，執(zhí)行其特定的功能甚至一級結(jié)構(gòu)上個別aa變化→特定功能的喪失或改變。最經(jīng)典的例子：鐮刀型紅細胞貧血病，即患者Hb2條β鏈第6位Glu→Val蛋白酶：個別aa突變（關(guān)鍵aa），酶活性喪失*要求：查找一級結(jié)構(gòu)中個別氨基酸突變蛋白，功能改變的實例蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計2、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)直接決定蛋白質(zhì)的功能一級結(jié)構(gòu)不能完全了解蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤曲構(gòu)成特有的穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)主要決定于空間結(jié)構(gòu)的完整性 ？去折疊——變性，一級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變—功能完全喪失—空間結(jié)構(gòu)的作用 ？蛋白質(zhì)去折疊的方法——物理、化學(xué)因子蛋白的性質(zhì)和功能，很難僅用蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的排列順序來解釋理解蛋白空間結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系對蛋白質(zhì)分子設(shè)計才是最重要的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)——高級結(jié)構(gòu)——功能關(guān)系，是蛋白質(zhì)分子設(shè)計的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計面臨的挑戰(zhàn)雖然解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐年增加，但依然無法滿足蛋白質(zhì)分子設(shè)計的需要？現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分子設(shè)計大多數(shù)主要依據(jù)一級結(jié)構(gòu)。——一次性成功的把握很??？蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計四、蛋白質(zhì)分子設(shè)計的流程蛋白質(zhì)分子設(shè)計——龐大工程蛋白質(zhì)分子設(shè)計程序構(gòu)建原蛋白質(zhì)模型建立和優(yōu)化突變體模型獲得蛋白質(zhì)的突變體結(jié)構(gòu)和功能分析驗證新的結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)通常，需要幾次循環(huán)才能達到目的蛋白質(zhì)分子設(shè)計流程需要計算機專家、X射線晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專家相互配合需要理論設(shè)計和試驗過程相結(jié)合，才能達到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計1、設(shè)計構(gòu)建蛋白質(zhì)突變體模型收集素材——構(gòu)建原蛋白質(zhì)模型：掌握和了解蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、功能域，理化特性、 結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、以及同源蛋白的相關(guān)信息。數(shù)據(jù)來源：查閱文獻和相關(guān)數(shù)據(jù)庫。對于已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，同源建模法或直接構(gòu)建模型。未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，要么先解析其晶體結(jié)構(gòu)，要么根據(jù)已知的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)預(yù)測。設(shè)計突變體——建立突變體模型——借鑒現(xiàn)有的經(jīng)驗（規(guī)則）改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：優(yōu)化蛋白的穩(wěn)定性、抗氧化性、對重金屬穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、酶學(xué)性質(zhì)如：Hartley等（1986年）完成有關(guān)蛋白質(zhì)一些重要性質(zhì)的設(shè)計目標及解決辦法表具有一定的參考價值。（Next）考慮不同氨基酸對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響（第七講結(jié)構(gòu)預(yù)測）Chou和Fasman對29種蛋白一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)：a—螺旋最強生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最強破壞者：Gly、Pro；β-折疊最強生成者：Gly、Ala、Ser；β-轉(zhuǎn)角最強生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最強破壞者：Ile、Val、Leu。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計蛋白質(zhì)重要性質(zhì)設(shè)計目標及解決辦法

設(shè)計目標

解決辦法Hartleyetal.（1986）思考：為什么能改善蛋白性質(zhì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計2、建立和優(yōu)化突變體模型（能量優(yōu)化以及蛋白質(zhì)動力學(xué)分析）利用能量優(yōu)化以及蛋白質(zhì)動力學(xué)分析的方法——預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)將預(yù)測結(jié)構(gòu)與原始蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)—功能或結(jié)構(gòu)—穩(wěn)定性相關(guān)知識預(yù)測新蛋白可能具有的性質(zhì)和功能蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計3、獲得蛋白質(zhì)突變體蛋白質(zhì)分子設(shè)計僅停留在理論層面上，沒有試驗證據(jù)，這種設(shè)計是沒有任何意義的。根據(jù)設(shè)計，合成蛋白質(zhì)，或改造蛋白質(zhì)突變體的基因序列，表達突變體蛋白，然后分離、純化得到所要求的蛋白質(zhì)。獲得突變體的方法和手段（詳見：蛋白質(zhì)純化與克隆修飾）分子生物學(xué)方法：獲得基因、定點突變、導(dǎo)入宿主細胞、表達基因的產(chǎn)物—蛋白質(zhì)分離純化：采用分離純化的方法—分離突變蛋白質(zhì)—測試→蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計4、結(jié)構(gòu)和功能分析——蛋白質(zhì)分子設(shè)計的流程對純化的蛋白質(zhì)突變體進行結(jié)構(gòu)和功能的分析和測試，與原蛋白質(zhì)比較，是否達到預(yù)期改造的目的。若得到的蛋白質(zhì)突變體沒有實現(xiàn)預(yù)期的功能，則需要重新設(shè)計和改造；若達到預(yù)期，則獲得一種具有特定功能的新蛋白。

蛋白質(zhì)分子設(shè)計是一門試驗性科學(xué)，是理論設(shè)計過程與實驗過程相結(jié)合的產(chǎn)物。理論設(shè)計與實驗過程兩部分相輔相成，才構(gòu)成了蛋白質(zhì)分子設(shè)計的全過程。再深入理解：（符合認識論的過程——實踐—認識—再實踐—再認識的過程）學(xué)習(xí)與知識（知—識）的應(yīng)用過程（掌握規(guī)律、利用規(guī)律、改造自然、做自然的主人）遇到問題、思考問題、采取對策、解決問題的過程做一個實驗：設(shè)計—實驗—再設(shè)計—再實驗任何事情：僅僅停留在理論層面上是毫無意義的!認識具有能動性意識對物質(zhì)具有反作用只要精神不滑坡，辦法總比問題多體會——深刻理解：試驗性科學(xué)=理論設(shè)計+實驗驗證蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計（一）獲得原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能信息 一級和高級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、同源蛋白、基因、理化性質(zhì)

（二）建立原蛋白分子的結(jié)構(gòu)模型（原蛋白結(jié)構(gòu)模型）模型來源：PDB或文獻實驗測試三維結(jié)構(gòu)—衍射、NMR……預(yù)測：如：同源蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

（三）結(jié)構(gòu)模型信息分析結(jié)構(gòu)特點——模體——結(jié)構(gòu)域功能活性區(qū)域及分布影響因素二硫鍵數(shù)目和位置（四）選擇設(shè)計目標（依據(jù)和實踐經(jīng)驗） （確定突變位點或序列，功能區(qū)二硫鍵數(shù)目和位置）五、設(shè)計思路（9個步驟）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計（五）突變體（序列）設(shè)計設(shè)計的原則

1.充分考慮氨基酸的極性，以利于形成特定的空間結(jié)構(gòu)

α-螺旋（LeuGlu），β-折疊（ValIle），β-轉(zhuǎn)角（ProGlyAsn) 2.充分考慮氨基酸的排列順序，以利于形成次級鍵構(gòu)成空間結(jié)構(gòu)設(shè)計的基本方法（下周詳細講述）序列最簡化法：少數(shù)幾個氨基酸設(shè)計的序列，往往具有一定的對稱性和周期性，從而減少設(shè)計的復(fù)雜性，并能檢測到一些蛋白質(zhì)折疊的規(guī)律和方式。模板組裝合成法：將各種二級結(jié)構(gòu)片段通過共價鍵連接到一個剛性的模板分子上，形成一定的三級結(jié)構(gòu)。繞過了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基來研究蛋白質(zhì)中長程作用力，是研究蛋白質(zhì)折疊和進行蛋白質(zhì)全新設(shè)計規(guī)律摸索的有效手段。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計（六）構(gòu)建和預(yù)測突變體模型→初步檢驗→修正設(shè)計結(jié)構(gòu)模型二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法：依據(jù)信息論和概率統(tǒng)計（ChouFasman法；Garnier方法；Cohen方法）三級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法和構(gòu)象搜索方法：依據(jù)基團之間相互作用的能量最低原理研究者具備的素質(zhì)：硬件（計算機軟件、高質(zhì)量立場）；軟件（結(jié)構(gòu)化學(xué)、物化和背景知識）；專業(yè)知識（七）獲得新設(shè)計的蛋白質(zhì)（合成新設(shè)計的蛋白質(zhì)）多肽化學(xué)合成法（固相合成技術(shù)）獲得新蛋白質(zhì)基因工程手段：PCR等基因操作-構(gòu)建突變體-表達-分離純化-新蛋白質(zhì)。（八）新蛋白質(zhì)的檢驗是否有多聚態(tài)？是否與設(shè)計吻合？是否有三級結(jié)構(gòu)？功能活性？（九）完成新蛋白質(zhì)的設(shè)計反復(fù)設(shè)計—反復(fù)修改——反復(fù)試驗→達到預(yù)期目標紙上談兵成本低廉蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計本節(jié)小結(jié)1、蛋白質(zhì)分子設(shè)計：通過蛋白質(zhì)模型和結(jié)構(gòu)預(yù)測來構(gòu)建具有新功能的蛋白質(zhì)2、分子設(shè)計分類：根據(jù)對蛋白質(zhì)改造的程度、根據(jù)改造對象分為兩類不同，蛋白質(zhì)分子設(shè)計分為三類3、掌握蛋白質(zhì)分子設(shè)計的程序 建?！鷥?yōu)化→獲得突變體→結(jié)構(gòu)和功能分析4、掌握蛋白質(zhì)設(shè)計思路（試驗性科學(xué)=理論設(shè)計+實驗過程）獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能信息建立分子設(shè)計的結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型信息分析選擇設(shè)計目標突變序列設(shè)計預(yù)測結(jié)果→初步檢驗正確度→修正設(shè)計結(jié)構(gòu)模型獲得新蛋白質(zhì)（合成新設(shè)計的蛋白質(zhì)）新蛋白質(zhì)的檢驗新一輪蛋白質(zhì)的設(shè)計蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計第二節(jié)部分氨基酸的突變部分氨基酸的突變——又稱“小改”，是基于對已知蛋白質(zhì)的局部改造。是目前蛋白質(zhì)工程中使用最廣泛的方法。思路：設(shè)計目標分子→基因序列或cDNA序列→定點突變→載體系統(tǒng)→宿主細胞表達→特定改變的蛋白質(zhì)分子→突變體與野生型蛋白性質(zhì)比較目的：改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和提高蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、增加活性、減少副作用、提高專一性闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系關(guān)鍵的問題：如何恰當(dāng)?shù)剡x擇要突變的位點（aa殘基）。解決問題的手段：通過蛋白分子設(shè)計——分析蛋白質(zhì)中殘基的性質(zhì)，借助于已有的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)或分子模型分析。（詳見以下五方面闡述）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計部分氨基酸改造——從以下五方面選擇“突變”位點

——針對不同的情況和目的，采取5種不同的改造方法根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定突變的位點（堿基）隨機突變?nèi)笔蛔兒徒宇^分區(qū)突變根據(jù)蛋白質(zhì)的同源性確定功能殘基選擇翻譯后修飾位點突變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計一、根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定突變位點已知高級結(jié)構(gòu)的蛋白：（X射線晶體或NMR譜高分辨率）根據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的位置來推測其功能。如果已知蛋白質(zhì)及其配基復(fù)合體的結(jié)構(gòu)（包括受體、底物、輔酶和抑制劑），——掌握了活性部分，對這些aa改造，這種方法則更有效。Why？與配基相互作用（形成氫鍵、離子鍵或疏水作用）的aa殘基，根據(jù)其與配基基團的距離和取向而確定——突變哪個aa。用定點突變的方式替換這些殘基，驗證這些殘基是否參與結(jié)合。這種方法是理解和證明——酶專一性和催化活性——基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計二、隨機突變什么是？物理和化學(xué)誘變劑（射線照射、化學(xué)試劑）—突變株—如：E.coli定向進化技術(shù)？——體外隨機突變技術(shù)優(yōu)勢：能非常容易地產(chǎn)生大量突變體。分析原則：—突變分析真正有功能的保守的氨基酸不能忍受各種類型的突變。如果突變，僅蛋白分子發(fā)生了結(jié)構(gòu)的改變，沒有破壞蛋白質(zhì)的功能，則該突變位點的殘基對結(jié)構(gòu)和功能的維系可能不是很重要的。突變分析的目的：對突變蛋白分子進行分析，確定突變位點和功能的關(guān)系突變體制備缺乏控制，制備和分析大量突變體，才能獲得可解釋的數(shù)據(jù)如：不同位置上的氨基酸殘基的幾種不同的替換，究竟哪一個是特異性的替換——特異性地影響蛋白功能獲得新的優(yōu)良性質(zhì)的蛋白質(zhì)——掌握新蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系缺點：需要獲得大量的分析突變體，才能解釋究竟哪一個突變是特異性。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計

三、缺失突變分析和接頭分區(qū)突變用能識別序列中多個位點的限制性內(nèi)切酶消化基因，并分離各個片段。為了產(chǎn)生分散的缺失，在重新連接之前用外切核酸酶消化線性DNA。為了產(chǎn)生分散的插入，可以將合成DNA的小片段（接頭）連接到切割位點上。通過重疊PCR方法，分別導(dǎo)入基因中缺失突變？基因中缺失1個或幾個堿基造成的突變。接頭分區(qū)突變？在整個基因各個位置上插入小量的核苷酸，觀察蛋白質(zhì)功能。用途：快速確定——基因編碼序列長度；功能上重要的結(jié)構(gòu)域。操作方法：利用經(jīng)典的重組DNA技術(shù)，在體外很容易地構(gòu)建。操作原理：轉(zhuǎn)座子誘變也是其中的一種方式蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計舉例：基因調(diào)節(jié)區(qū)DNA序列重要元件的定位。如：HIV逆轉(zhuǎn)錄酶p66亞基（包括兩個更小的亞基p51和p15），兩個小亞基有什么作用呢？用接頭插入突變分析。聚合酶功能位于N端，編碼p51亞基，RNaseH功能則位于C端，編碼pl5亞基。鑒定鼠和人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子

(GM-CSF)關(guān)鍵的活性區(qū)域。突變目的：了解基因的長度和不同區(qū)域的功能和作用快速掃描編碼序列的長度并鑒定功能上重要的結(jié)構(gòu)域，進一步以單一氨基酸替換的方法進行更精細的分析。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計

四、利用蛋白質(zhì)的同源性確定功能殘基？：通過序列同源性比對分析，確定突變位點的方法。我們知道 每個殘基的功能信息，能夠通過比對分析不同種屬的同源蛋白質(zhì)的序列獲得。兩種假設(shè)——（用于定點突變技術(shù)分析蛋白質(zhì)）同源蛋白結(jié)構(gòu)域中：保守的殘基和非保守的殘基。保守殘基可能參與相同功能，或者在維持相同結(jié)構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在同源蛋白質(zhì)中差異很大的殘基可能不重要，或者在蛋白質(zhì)分子識別方面發(fā)揮重要作用。設(shè)計實驗驗證（假設(shè)）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計1、保守殘基的突變——蛋白激酶家族基因分析，2個Asp完全保守，Brenner推測有重要作用，見下圖。酵母菌突變驗證，Ala替換Asp。替換Asp210，kcat下降300倍，而與底物結(jié)合的Km值則不受影響。 推測Asp210在催化中發(fā)揮基本作用的殘基。替換Asp228，活性完全喪失。突變了118個殘基，只有替換Asp228，活性的完全喪失，證明了個殘基的重要性。哺乳動物cAMP儂賴的蛋白激酶晶體結(jié)構(gòu)的證據(jù)，與Brenner的推測一致。保守殘基的研究對理解關(guān)鍵氨基酸殘基與蛋白活性關(guān)系具有重要的意義Asp210Asp228p126蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計2、非保守殘基的突變在蛋白質(zhì)家族中，非保守的殘基與家族成員（包括種屬間的變種）的特異性有關(guān)，如：病毒的毒力。用定點突變方式進行替換——獲得很多生物學(xué)活性的信息， 也可以獲得具有新特異性的突變體蛋白質(zhì)。舉例：脊髓灰質(zhì)炎病毒（2種型）：非毒型（I）和毒型（II）Ⅱ型誘發(fā)小鼠脊髓灰質(zhì)炎，I型對小鼠無毒性。Ⅱ型毒力喪失的突變體證明：90-105殘基負責(zé)Ⅱ型病毒對小鼠的毒力若將Ⅱ型的95-104殘基環(huán)區(qū)域轉(zhuǎn)移到無毒力的I型毒株中，雜合I型毒株表現(xiàn)出對小鼠的毒力，表明：脊髓灰質(zhì)炎病毒識別鼠細胞受體，環(huán)區(qū)發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計五、翻譯后修飾位點突變?yōu)槭裁匆M行翻譯后修飾位點的突變？Protein很多翻譯后修飾，（如：磷酸化、糖基化、?；?、羧基化、甲基化