《生化大實(shí)驗(yàn)》課件

《生化大實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)課程簡介生化大實(shí)驗(yàn)是一門綜合性的實(shí)驗(yàn)課程，教學(xué)的目的在于通過對(duì)生命物質(zhì)的分離制備，純化，分析等綜合性實(shí)驗(yàn)，在已掌握的基礎(chǔ)生物化學(xué)理論知識(shí)和生化實(shí)驗(yàn)常用方法的基本原理、基本操作技術(shù)（如滴定、比色、層析、電泳等）的基礎(chǔ)上，訓(xùn)練學(xué)生的綜合實(shí)踐動(dòng)手能力，掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸等重要物質(zhì)的分離、純化等的測定技術(shù)。目錄實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量的測定實(shí)驗(yàn)二離子交換法血清純化實(shí)驗(yàn)三離子交換層析法分離血清白蛋白實(shí)驗(yàn)四聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量實(shí)驗(yàn)五等電聚焦法測定樣品的等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)六質(zhì)粒的分離與純化實(shí)驗(yàn)七擴(kuò)增目的基因片段實(shí)驗(yàn)八酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量的測定（一）考馬斯亮藍(lán)法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合法的原理，定量測定微量蛋白質(zhì)濃度快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)存在著兩種不同樣色形式，紅色棕黑色和藍(lán)色。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后有紅色棕黑色和藍(lán)色形式，最大光吸收由變成，測定吸光的增加量，可以測定與其結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)與染料結(jié)合速度很快，就可以反應(yīng)完全，并可以穩(wěn)定，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有很大的消光系數(shù)，使得測定蛋白質(zhì)濃度是靈敏度很高。測定范圍為μ蛋白質(zhì)，微量測定時(shí)達(dá)到μ蛋白質(zhì)。此反應(yīng)反復(fù)性好精度高，線性關(guān)系好?！緦?shí)驗(yàn)儀器及用品】.標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（）結(jié)晶牛血清白蛋白用稀釋到。..考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)溶于乙醇中，加磷酸，蒸餾水稀釋，濾紙過濾。.待測蛋白：人血清，用前用稀釋倍。.漩渦混合器.移液管（×），（×），（×）

.分光光度計(jì)

.試管×(×)

.量筒(×)

.電子分析天平

.試管架(×)【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟】一、標(biāo)準(zhǔn)曲線線的繪制取支干凈試管，按下表進(jìn)行編號(hào)并加入試劑。以為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)年濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試劑號(hào)試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白液

考馬斯亮藍(lán)染液搖勻，小時(shí)內(nèi)以號(hào)管為空白對(duì)照，在處比色

.未知樣液的測定

另取一干凈試管，加入樣品及考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫靜置，于波長處比色，讀取吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找蛋白質(zhì)濃度。

【注意事項(xiàng)】

、如果測定的要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入內(nèi)測定吸光度，在這段時(shí)間內(nèi)樣色很穩(wěn)定。

、測定中，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物會(huì)吸附在比色皿上，實(shí)驗(yàn)證明可以忽視。測定完后可以用乙醇洗干凈?！舅伎碱}】、根據(jù)一下要求選擇一種或者幾種蛋白質(zhì)定量測定蛋白質(zhì)濃度。（）樣品不容易溶解，但要求結(jié)果很準(zhǔn)確。（）要求在半天內(nèi)測定個(gè)樣品。（）要求很迅速的測定一系列試管（只）中溶液的蛋白質(zhì)濃度。、試著比較該法與其他幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。二、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理。.掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和使用方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，因此可作蛋白質(zhì)定量分析。利用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，因此廣泛應(yīng)用與蛋白質(zhì)和酶的生化制備。此法的缺點(diǎn)是：對(duì)酪氨酸和苯丙氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)測定有一定誤差。若樣品種含有嘌呤嘧啶等會(huì)出現(xiàn)比較大的干擾，此時(shí)必須同時(shí)測定和吸光度，通過公式校正測定，以消除核酸的影響，而推算處蛋白質(zhì)濃度。

不同蛋白質(zhì)和核酸吸收是不同的，即使校正也存在誤差，但是可以做為初步測定。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為—?！緝x器與試劑】

.紫外分光光度計(jì)，比色管（的個(gè)），吸量管。

.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：

溶液溶解結(jié)晶牛血清白蛋白，稀釋到。

.待測蛋白溶液：用酪蛋白配制，濃度在

.

溶液

.試管×（×）

.移液管（×），（×），（×）?！緦?shí)驗(yàn)步驟】

、標(biāo)準(zhǔn)曲線法

（）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取只試管按表加入試劑，搖勻。選擇光程石英比色皿，在波長測定，以值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)蛋白液蒸餾水蛋白質(zhì)濃度表紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（）樣品測定：

配制待測蛋白質(zhì)溶液，加入蒸餾水，搖勻，測定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)濃度。

.直接測定法

在紫外分光光度計(jì)上，將待測蛋白質(zhì)溶液加入比色皿，以生理鹽水為對(duì)照，測定和波長吸光度。按一下公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度（）

(為蛋白質(zhì)濃度，和分別為蛋白質(zhì)溶液在和處測得的吸光度值)。本法適用于微量蛋白質(zhì)濃度測定，對(duì)鹽類混雜的情況比較合適，為簡便起見，對(duì)混合蛋白質(zhì)溶液，可用×來表示蛋白質(zhì)大概濃度。

【注意事項(xiàng)】

由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，顯色深淺隨不同蛋白質(zhì)改變，因而本法只適用于蛋白質(zhì)相對(duì)濃度的測定，核酸對(duì)結(jié)果也有影響，盡管進(jìn)行了公式校正，但是不同樣品干擾成分差異較大，致使紫外吸收法檢測的準(zhǔn)確性較差。

【思考題】

.

紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度的原理是什么？

.影響紫外分光光度法測定準(zhǔn)確性的因素有那些？三、酚法測定蛋白質(zhì)濃度【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜し臃y定蛋白質(zhì)濃度的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】酚法又稱法。首先在堿性溶液中形成銅蛋白質(zhì)復(fù)合物，后與磷鉬酸磷鎢酸作用，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物，這中復(fù)合物在和處有最大吸收峰，顏色與蛋白質(zhì)濃度成正比，進(jìn)而可以計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。【材料、試劑、與器具】.酚（堿性銅試劑）：碳酸氫鈉和氫氧化鈉雙蒸水定容為儲(chǔ)備液；五水硫酸銅，定容，為儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液和儲(chǔ)備液混合為溶液,混合后一日有效。.酚：鎢酸鈉、鉬酸鈉、蒸餾水、磷酸、濃硫酸在磨口圓底小瓶中混勻后接上磨口冷凝管，回流再加入硫酸鋰、蒸餾水及液溴數(shù)滴，開口煮沸，冷卻，稀釋至過濾，至微綠，儲(chǔ)存于棕色瓶。臨用前氫氧化鈉滴定，用酚酞做指示劑，據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至的酸，冰箱保存。、標(biāo)準(zhǔn)濃度牛血清蛋白溶液μ

、分光光度計(jì)

、刻度吸管（×），（×），（×）

、試管只

、恒溫水浴

【操作步驟】

、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取只試管，按下表加入試劑:試劑牛血清蛋白溶液蒸餾水酚酚第一次第二次總體積加入試劑后，混勻，室溫，在加酚，混勻后，再第二次加，混勻放置。于比色，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

、樣品測定

取樣品按上表加試劑，處比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)濃度。

【思考題】

、酚法測定蛋白質(zhì)濃度的原理是什么？

、影響酚法測定蛋白質(zhì)濃度的準(zhǔn)確性的因素有那些？四、雙縮脲法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私怆p縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。【原理】蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與＋形成紫紅色絡(luò)合物，在波長處有最大吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，可以用比色法定量測定雙縮脲法通常用于需要快速但不十分精確的測定?！驹噭┖推鞑摹?/p>

.牛血清白蛋白溶液

.容量瓶（×）

.試管×（×）

.雙縮脲試劑：溶解硫酸銅（）溶于水中，在容量瓶中加入濃氨水、冷蒸餾水和飽和氫氧化鈉，搖勻，室溫定容，搖勻備用。在攪拌下加入氫氧化鈉溶液，用水稀釋到，貯存在內(nèi)壁涂以石臘的瓶中。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。.吸量管（，，）

.型分光光度計(jì)

【操作步驟】

.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取只試管編號(hào)，按下表加入試劑，即得種不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。

另取試管只，按、、、、、、編號(hào)，號(hào)分別加上述蛋白質(zhì)溶液號(hào)為對(duì)照，加蒸餾水分別加入，各試管中加雙縮脲試劑混勻，紫色出現(xiàn)后，與測定吸光度，閉塞測定法務(wù)必在內(nèi)完成，繪制蛋白質(zhì)濃度—吸光度曲線。容量瓶編號(hào)牛血清蛋白溶液蒸餾水蛋白質(zhì)濃度稀釋至刻度稀釋至刻度稀釋至刻度稀釋至刻度稀釋至刻度稀釋至刻度.未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定

取樣品于試管中，加雙縮脲試劑混勻，于處測定其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出蛋白質(zhì)濃度。

【思考題】

.本法與其他測定蛋白質(zhì)濃度的方法比較，有那些優(yōu)點(diǎn)？

.若樣品中有干擾測定的雜質(zhì)，應(yīng)該如何校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果？實(shí)驗(yàn)二離子交換法血清純化【實(shí)驗(yàn)原理】（二乙氨基乙基葡萄糖凝膠）為弱堿性陰離子交換劑。用將型轉(zhuǎn)變?yōu)樾秃?，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為～），其余均屬酸性蛋白?！沫h(huán)境中。酸性蛋白均被吸附，只有γ球蛋白便可在洗脫液中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的?！驹噭┡c器材】..和..().％..無水乙醇.紫外分光光度計(jì).×玻璃層析柱.自動(dòng)部分收集器【操作步驟】．預(yù)處理稱（下稱），懸于蒸餾水內(nèi)，后傾去上層細(xì)粒。按每克加的比例，將浸泡于液中，攪勻，靜置，裝入布氏漏斗（墊有層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至呈中性；再以同上操作過程處理，最后以再處理一次，處理完后，將浸泡于中過夜。．裝柱

（）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。（）將()沿玻璃棒倒入柱中至高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的。待凝膠沉降～高時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀凝膠至所需高度。（）關(guān)閉出水口，待凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。．平衡啟開出水口螺旋夾，控制流速滴，使約倍床體積的洗脫液流出。并以計(jì)與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。．加樣及洗脫啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（血清，體積應(yīng)小于床體積的，蛋白濃度以＜為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁～次；再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速，滴.．收集開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集；每管收集.共收集～管。

．測蛋白以型紫外分光光度計(jì)分別測定每管，按公式計(jì)算各管蛋白含量。并以為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

．合并、濃縮將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以（）濃縮至所需體積，加入％防腐，于℃保存?zhèn)溆?。長期保存時(shí)應(yīng)貯于℃冰箱。

．凝膠的再生在柱上先以洗脫雜蛋白至流出液的<，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將再處理一遍即達(dá)再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中℃保存；近期不用時(shí)，以無水酒精洗次，再置℃溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。實(shí)驗(yàn)三離子交換層析法分離

血清白蛋白【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^對(duì)白蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用離子交換層析手段分離蛋白質(zhì)純品的技能。【基本原理】離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團(tuán)的可逆交換反應(yīng)。利用這個(gè)反應(yīng)先將要分離的混合物在一定的溶液中解離，而后流經(jīng)固定相，使之與固定相上的可解離基團(tuán)進(jìn)行離子交換，吸附于固定相上，凡不能進(jìn)行交換吸附的成分，則流出層析柱外。再根據(jù)交換吸附于固定相的各組分解離力度的差別，運(yùn)用不同的值或不同鹽濃度的溶液作流動(dòng)相，流過層析柱將各組分分別再交換洗脫下來，這樣混合物的各組分即被分開，達(dá)到分離的目的，此即為離子交換層析?！驹噭┡c器材】

.磺酰水楊酸.－.（）：取、混合，用酸度計(jì)檢查值應(yīng)為。取該混合液用蒸餾水稀釋至。..和.試劑.×層析柱.黑、白比色板【操作步驟】

.－纖維素的活化處理：

()?。w維素（－纖維素的量（干重），一般按樣品的蛋白質(zhì)量計(jì)算，大約是蛋白質(zhì)量的倍）懸于溶液中，浸泡過夜，用錐形瓶盛裝；

()次日，在布氏漏斗上輕吸過濾，用蒸餾水洗，直至左右，抽干；

()用浸泡，用蒸餾水洗凈，直至左右，抽干；()（）浸泡；

()傾去微細(xì)顆粒（浮懸），加入（）使容積為沉淀體積的倍；

.關(guān)閉柱的出口，向柱內(nèi)加入體積的（）,將－懸浮液用玻棒引流連續(xù)倒入柱內(nèi)，當(dāng)交換劑沉積到底部時(shí)，打開流出口，讓緩沖液緩慢流出，再倒入更多的懸液，直至整個(gè)用量加完為止；

.將柱與儲(chǔ)液瓶（內(nèi)盛同樣）連接，流洗幾個(gè)柱體積的緩沖液，使柱床穩(wěn)定，并使得流出液為；.純化γ球蛋白：取實(shí)驗(yàn)所保存溶液（γ球蛋白），再對(duì)（）透析，更換數(shù)次，使蛋白質(zhì)溶液中為；

.將透析后的粗提樣品緩緩加在柱床頂部，打開出水口，待樣品全部進(jìn)入柱床后，緩慢流入（），調(diào)整流速至，開始用管收集洗脫液，每管，先用磺酰水楊酸檢測有無蛋白質(zhì)流出（蛋白質(zhì)遇磺酰水楊酸顯白色，故用黑色比色板），待蛋白質(zhì)流出后，迅速收集蛋白液（視收集量和蛋白質(zhì)的濃度可選擇用濃縮）。此不被吸附的即為純化的γ球蛋白；.將收集到的蛋白液合并，紫外分光光度計(jì)法(見實(shí)驗(yàn))測定蛋白質(zhì)的含量，取部分溶液進(jìn)行純度鑒定、分子量和等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)；

.用完的凝膠柱用流洗干凈，再用緩沖液（）流洗平衡后可重復(fù)使用，但應(yīng)將頂部吸去并新添，暫不用時(shí)可將其倒出，浸于正丁醇的緩沖液中，以防霉變。.純化白蛋白取上一實(shí)驗(yàn)所保存溶液（白蛋白）,再對(duì)（）透析，更換數(shù)次，使蛋白質(zhì)溶液中為；透析后白蛋白樣品上柱后，改用緩沖液（）洗滌，流出約（其中含α–及β–球蛋白）后，將柱上的緩沖液面降至與纖維素床表面平齊。然后改用緩沖液（）洗脫，并用磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)。由于純化的白蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì)，故肉眼可見一層淺黃色的成分被緩沖液洗脫下來，大約改用洗脫約時(shí)，即可試出有蛋白質(zhì)白色混濁，立即連續(xù)收集管，每管滴，此即為純化的白蛋白液，取其中蛋白質(zhì)濃度高的兩管留作含量測定和純度鑒定用（視收集量和蛋白質(zhì)的濃度可選擇用濃縮）。用過的–層析柱，應(yīng)重新再生平衡，方法如下，先用–流洗，再用（）流洗平衡即可。暫不用時(shí)可將其倒出，浸于正丁醇的緩沖液中，以防霉變。【注意事項(xiàng)】

.裝柱時(shí)柱子一定要垂直；

.裝柱時(shí)應(yīng)注意，柱床內(nèi)不得產(chǎn)生界面、氣泡，表面要平整；

.柱子用完后一定要用高濃度的鹽溶液洗凈。實(shí)驗(yàn)四聚丙烯酰胺（）凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)分子量的原理。.掌握垂直板電泳的操作方法。.運(yùn)用測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定?！净驹怼烤郾０纺z電泳具有較高的分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。將已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知相對(duì)分子量的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得它的相對(duì)分子量。也可以用相關(guān)分析軟件得出回歸方程并計(jì)算出結(jié)果?！緝x器、材料與試劑】

（一）儀器

.電泳儀

．垂直平板電泳槽

．微量進(jìn)樣器

（二）材料

.：

.血清（三）試劑

.凝膠貯液：丙稀酰胺（）、雙丙稀酰胺（），溶解，定容至。

.緩沖液：加入使之溶解，再加入溶液，混勻后在計(jì)上調(diào)至，最后加定容至。

.分離膠緩沖液：加入溶液，再加到，。.電極緩沖液：、甘氨酸、，定容至。

.樣品緩沖液：甘油、巰基乙醇、、溴酚藍(lán)、（）緩沖液，定容至。

.過硫酸銨（）溶液：溶于中（要求現(xiàn)用現(xiàn)配）。

.四甲基乙二銨（）。.染色液：考馬斯亮蘭，溶于固定液中，混勻。

.脫染液：冰醋酸、甲醇、水，混勻。

.標(biāo)準(zhǔn)蛋白（次高分子量）。

.濃縮膠緩沖液：加溶液，加到，。

.固定液：取甲醇，冰醋酸混勻。【實(shí)驗(yàn)步驟】

.將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，安裝好；用的瓊脂糖電泳緩沖液（瓊脂糖溶于 電泳緩沖液）封嚴(yán)玻璃板的邊和底（保證不漏膠新式電泳槽此步免）；

.配分離膠（（）＋凝膠溶液＋蒸餾水，μ溶解，混勻后再加入μ和μ，混勻）;

.將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽高三分之二處，加高的蒸餾水密封。待膠凝固后（約需）倒掉水，用吸水紙吸干；配濃縮膠（（）＋凝膠溶液＋蒸餾水，μ溶解，混勻后再加入μ和μ，混勻），將配好的濃縮膠

立即倒入凝膠槽（插入梳子不溢出為宜），插入梳子；對(duì)于不同分子量樣品建議使用的凝膠濃度分子量膠濃度（）<×××××>×.待膠凝固后，拔出梳子，加入電泳緩沖液（淹沒膠，但不高于電泳槽）；

.樣品處理：取標(biāo)準(zhǔn)蛋白或樣品μ，加入μ樣品緩沖液，混勻，℃水浴加熱。

.進(jìn)樣：將處理好的樣品μ加入到凝膠孔中，連接電泳儀；

.電泳：打開電源，調(diào)整電壓至，開始電泳，待樣品全部進(jìn)入凝膠后，將電壓調(diào)至，待指示劑（溴酚蘭）到達(dá)凝膠的底部距離下緣時(shí)停止電泳，取下玻璃板，小心地把其中一塊玻璃板從凝膠上取下來，測量分離膠的長度及分離膠上沿至溴酚藍(lán)帶中心的距離，記錄于表中，或者在溴酚藍(lán)帶的中心插入一段細(xì)銅絲以標(biāo)出染料的位置，取出分離膠（注意保持膠的完整性）；

.固定：將膠置于固定液中浸泡；

.染色：將分離膠浸入染色液中染色；.脫染：取出分離膠，先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，室溫浸泡凝膠或℃加熱使其脫色，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止；

.將膠片小心放置于一塊玻璃板上，分別測量分離膠的長度、樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的泳動(dòng)距離（分離膠上沿至各蛋白區(qū)帶中線的距離）；

.凝膠照相；、電泳遷移率的計(jì)算

（）不插銅絲的計(jì)算方法：

遷移率（蛋白質(zhì)移動(dòng)距離染料移動(dòng)距離）×（染色前膠長脫色后膠長）

（）插銅絲的計(jì)算方法：

遷移率蛋白質(zhì)移動(dòng)距離染料移動(dòng)距離、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品遷移率做橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量作縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，即可得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（也可取蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值用一般坐標(biāo)紙作圖）。測得待測蛋白質(zhì)的遷移率后，由曲線上即可查出其分子量?！咀⒁馐马?xiàng)】

．丙烯酰胺具有中等毒性.常人每天允許的最大暴露量不超過μ,皮膚接觸可致中毒,癥狀為紅斑,脫皮,眩暈,動(dòng)作機(jī)能失調(diào),四肢無力等.

．沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近，一定要催化充分,使之完全聚合，集中處理,實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過訓(xùn)練的人收集到一起,在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存,并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全,最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉庫,統(tǒng)一處理.

．待測樣品如果蛋白含量低于，處理之前應(yīng)先濃縮至；若高于，處理之前應(yīng)先稀釋至?！舅伎碱}】

.在不連續(xù)體系中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么?

.電極緩沖液中甘氨酸的作用?

.在不連續(xù)體系中,分離膠與濃縮膠中均含有和,試述其作用?

.樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?實(shí)驗(yàn)五等點(diǎn)聚焦測定蛋白質(zhì)

的等電點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握凝膠等電聚焦的基本原理。.學(xué)習(xí)用等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的操作和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)（酶）、多肽等兩性電解質(zhì)，其所帶電荷的數(shù)量與性質(zhì)，隨所處環(huán)境的而變化。環(huán)境低于其等電點(diǎn)時(shí)，帶正電荷，在電場中向陰極移動(dòng)；環(huán)境高于其等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電荷，在電場中向陽極移動(dòng)；環(huán)境等于其等電點(diǎn)時(shí)，不帶電荷，在電場中不移動(dòng)。據(jù)此，在電泳系統(tǒng)中創(chuàng)造一個(gè)由陽極向陰極，由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定梯度環(huán)境，那么處在這種系統(tǒng)中具有不同等電點(diǎn)的各種蛋白質(zhì)，將根據(jù)所處環(huán)境的與其自身等電點(diǎn)的差異，分別帶上正電荷或負(fù)電荷，并向與它們各自的等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)沫h(huán)境位置處移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)該位置時(shí)即停止移動(dòng)，從而各自焦聚（聚焦），分別形成一條集中的蛋白質(zhì)區(qū)帶。這種根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同而將它們分開的電泳方法稱為等電聚焦電泳。電泳后測定其各種蛋白質(zhì)“聚焦”部位的，即可得知它們的等電點(diǎn)。（一）儀器

.電泳儀

．垂直平板電泳槽(園盤電泳)

（二）材料

.：

.血清

（三）試劑

.兩性電解質(zhì)，，濃度。

.丙烯酰胺（）溶液：，甲叉雙丙烯酰胺（），蒸餾水溶解后定容至，過濾，℃保存。.

．溶液：臨用時(shí)配制。

．正極緩沖液：()硫酸或磷酸。(磷酸配成)

．負(fù)極緩沖液：()乙二胺水溶液。(配成)

．固定液：()三氯乙酸。

．染色液：考馬斯亮藍(lán)以甲醇溶解。使用時(shí)取，加入冰醋酸，搖勻即可使用。

．脫色液：按份甲醇、份水和份冰醋酸混合即可?！緦?shí)驗(yàn)步驟】凝膠制備：按下表配制凝膠。水：凝膠儲(chǔ)液：：蛋白質(zhì)樣品：（）：：吸取丙烯酰胺凝膠儲(chǔ)液，和水于的小燒杯中混勻，在真空干燥器中抽氣（本實(shí)驗(yàn)將次步省略，并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。然后加入、待測樣品和溶液，混勻后立即制膠（方法同電泳），膠液加至距離頂部處，在膠面上覆蓋厚的水，應(yīng)注意不要讓水破壞膠的表面，室溫下放置即可聚合。為觀察聚焦?fàn)顩r，可在樣品中加入聚焦指示劑，如帶紅顏色的肌紅蛋白（）、細(xì)胞色素（）或甲基紅染料（），以示聚焦的進(jìn)展情況。.電泳：吸去凝膠表面上的水層，于電泳槽正極緩沖液加入的硫酸（或磷酸），負(fù)極加入的乙二胺（或乙醇胺或）。打開電源，將電壓恒定為，因?yàn)榫劢惯^程是電阻不斷加大的過程，故聚焦電泳過程中，電流不斷下降，降至穩(wěn)定時(shí)，即表明聚焦已完成，繼續(xù)電泳約后，停止電泳。

.剝膠：電泳結(jié)束后，取下膠塊，分別于正負(fù)兩極做上標(biāo)記，切不可弄混，并測量出凝膠的長度。.固定、染色和脫色：固定液中浸泡，然后轉(zhuǎn)移至脫色液中浸泡，換次溶液，每次浸泡過程中不斷搖動(dòng)，以除去。量取并記錄漂洗后的膠長。再把膠放置于染色液中，室溫染色，取出用蒸餾水洗后，放在脫色液中脫色，不斷搖動(dòng)，并更換次脫色液，待本底顏色脫去，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰時(shí)，量取并記錄凝膠長度以及蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至正極端的距離。.梯度的測量：在未固定前將凝膠縱切為兩部分，一部分用于進(jìn)行第四步，另一部分（三條泳道即可）按從正極端向負(fù)極端的順序切成的區(qū)段，按次序放入有標(biāo)號(hào)的、裝有蒸餾水的試管中，浸泡過夜，然后用精密試紙測出每管浸泡液的并記錄。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好用精密計(jì)測定。、結(jié)果測定：

（）梯度曲線的制作：以膠長（）為橫坐標(biāo)，各區(qū)段對(duì)應(yīng)的的平均值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條近似直線的梯度曲線。由于測得的每一管的是長一段凝膠各點(diǎn)的平均值，因此作圖時(shí)可把此視為小段中心區(qū)的，于是第一小段的所對(duì)應(yīng)的凝膠長度為；第二小段的所對(duì)應(yīng)的凝膠長度為（×－）；由此類推，第小段的所對(duì)應(yīng)的凝膠長度為（－）。（）待測蛋白樣品等電點(diǎn)的計(jì)算：

①按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠正極端的實(shí)際長度（表示）：

×

式中——染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至凝膠正極端的長度

——凝膠固定前的長度

——凝膠染色后的長度

②根據(jù)上式計(jì)算待測蛋白的，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的，即為該蛋白的等電點(diǎn)?！咀⒁馐马?xiàng)】

.鹽離子可干擾梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)行時(shí)，樣品應(yīng)透析或用脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。

.加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍(lán)染色，加樣量可為；如用銀染色，加樣量可減少到。一般樣品濃度以為宜，最適當(dāng)加樣體積為。.通常，窄范圍的梯度可以提高分辨率，但是需要時(shí)間也比較常，梯度范圍為是較好的選擇。

.由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制，最長的凝膠長度為－，實(shí)際上，分別電泳幾塊不同的梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好。

.在變性液中加入％－以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如和－等兩性離子去垢劑。【思考題】．凝膠等電聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的原理？.凝膠等電聚焦電泳法操作時(shí)應(yīng)注意的問題？實(shí)驗(yàn)六質(zhì)粒的分離與純化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法分離提取質(zhì)粒?！緦?shí)驗(yàn)原理】堿裂解法去、提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色體在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在值介于這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變形，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤旋，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體與不穩(wěn)定的大分子，蛋白質(zhì)復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。【儀器、材料與試劑】（一）儀器恒溫培養(yǎng)箱；恒溫?fù)u床；臺(tái)式離心機(jī)；高壓滅菌鍋（二）材料.葡萄糖.三羥甲基氨基甲烷.已二胺四乙酸.氫氧化鈉.十二烷基硫酸鈉

.乙酸鉀

.冰乙酸

.氯仿

.乙醇

.胰酶

.氨芐青霉素

.蔗糖.溴酚藍(lán)

.酚

.羥基喹啉

.巰基乙醇

．鹽酸

.質(zhì)粒的大腸桿菌

.吸頭、小指管（三）試劑

.溶液Ⅰ

葡萄糖

三羥甲基氨基甲烷

乙二胺四乙酸

.溶液Ⅱ

氫氧化鈉，用前等體積混合

.溶液Ⅲ乙酸鉀

冰乙酸

水

.緩沖液

()

()

.乙醇

.胰酶

將酶溶于、氯化鈉中，配成的濃度，于攝氏度加熱分鐘，緩慢冷卻至室溫，保存于攝氏度。

.凝膠加樣緩沖液()：蔗糖、溴酚藍(lán)

.酚【實(shí)驗(yàn)步驟】（一）提取質(zhì)粒.將毫升含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入上述的含質(zhì)粒的大腸桿菌，攝氏度振蕩培養(yǎng)過夜。.取毫升培養(yǎng)物倒入微量離心管中，離心分鐘。.吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。.將細(xì)菌沉淀懸浮于溶液中，充分混勻，室溫放置分鐘。．加溶液，蓋緊管皿，混勻內(nèi)容物，將離心管放在冰上分鐘。

.加入溶液，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置分鐘。

.。離心分鐘，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。

.向上清中加入等體積酚：氯仿（：），反復(fù)混勻，，離心分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

.向上清加入倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置分鐘，離心分鐘。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。.用乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。

.加緩沖液，其中含有的胰酶，使完全溶解，攝氏度保存。

（二）對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行純化：

瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒，采用膠回收試劑盒純化質(zhì)粒。

【實(shí)驗(yàn)安排】

本實(shí)驗(yàn)一天內(nèi)可做完。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可結(jié)合下一個(gè)實(shí)驗(yàn)一起觀察。

實(shí)驗(yàn)七擴(kuò)增目的基因片段【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)反應(yīng)的基本原理。.了解擴(kuò)增過程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。.掌握的基本操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（,）的原理類似于的天然復(fù)制過程。在待擴(kuò)增的片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍。.變性：加熱使模板在高溫下（℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。.退火：使溶液降溫至～℃，模板與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。.延伸：溶液溫度升至℃，耐熱聚合酶以單鏈為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的種脫氧核苷三磷酸（）,按照’→’方向復(fù)制出互補(bǔ)，即引物的延伸階段。

上述步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過～個(gè)循環(huán)后可擴(kuò)增～倍。

典型的反應(yīng)體系由如下組分組成：模板、反應(yīng)緩沖液、、、兩個(gè)合成的引物、耐熱聚合酶?！緝x器、材料與試劑】

（一）儀器

.熱循環(huán)儀

.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

.臺(tái)式離心機(jī)

.微量移液器

.微波爐（二）材料

.模板

.上游和下游

（三）試劑

.反應(yīng)物：聚合酶，種混

合液（）。

.×溴酚藍(lán)上樣緩沖液。

.×電泳緩沖液：，乙酸，()，加水到，高壓滅菌后備用?！緦?shí)驗(yàn)步驟】

.分別在兩個(gè)滅菌的離心管中，按加樣表的順序加樣（整個(gè)加樣過程聚合酶放于冰中保持低溫），建立μ反應(yīng)體系。成分體積終濃度×μ×（種混合物）μ每種μ(上游)μμμ(下游)μ模板μ～μ～μ聚合酶μ至μ.在儀上設(shè)置如下程序進(jìn)行擴(kuò)增

①℃預(yù)變性；

②℃變性；

③℃退火；

④℃延伸；

⑤重復(fù)步驟②～④，約次；

⑥℃延伸；

⑦℃保溫。.瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果取～μ反應(yīng)液及μ上樣緩沖液混合，進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)大小的分子量標(biāo)準(zhǔn)，檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后，染色，紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必要時(shí)拍照?！咀⒁馐马?xiàng)】

.是建立在一定量的模板和與之專一性互補(bǔ)配對(duì)的一對(duì)引物之上的，因此，在進(jìn)行之前，模板的純化和引物設(shè)計(jì)尤為重要。

.對(duì)聚合酶的活性影響很大，有時(shí)按照試劑商提供的說明擴(kuò)增不出目的基因時(shí)，不妨適當(dāng)增加的濃度。

.模板和引物的濃度要適量，并不是越多越好，否則，會(huì)出現(xiàn)非特異條帶