玉米芯提取木聚糖及其酶促反應(yīng)溫度的研究

玉米芯提取木聚糖及其酶促反應(yīng)溫度的研究

大自然最常見的現(xiàn)象是硬木植物和其他植物（如水稻、谷物、草本植物等）中的木聚糖。半養(yǎng)分木聚糖。通過共價鍵和非共價鍵的連接而形成的木聚糖、纖維素和木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu),木聚糖在被子植物來源的硬木質(zhì)中,占植物細(xì)胞壁總量的15～30%。木聚糖是一種通過β-1,4-糖苷鍵連接β-D-吡喃型木糖單元而構(gòu)成主鏈的異質(zhì)多糖。大部分木聚糖是異型多糖,主鏈或側(cè)鏈上帶有多種不同的取代基。常見的取代基有葡萄糖醛酸、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、α-L-阿拉伯呋喃醛酸、乙酰基、阿魏?；蚿-香豆?；鵞4、5]。經(jīng)酶水解可生產(chǎn)國際市場上急需的低聚木糖、木糖等療效食品[6、7]。木聚糖作為生產(chǎn)木聚糖和木糖的原料是十分重要而必須的,但實(shí)際上商品木聚糖十分昂貴,無法作為生產(chǎn)原料,這時就需要探討量足價廉的木聚糖的生產(chǎn)方法。此文通過堿解玉米芯這兩種容易獲得的原料而得到木聚糖,為后續(xù)酶解木聚糖得到木寡糖提供了基礎(chǔ)。近來,木聚糖被看成是最重要的可再生資源之一,是因為它對通過化學(xué)修飾反應(yīng)而得到的新生物多聚體材料以及功能聚合物有著重要的基礎(chǔ)作用[8、9]。木聚糖也因為其中功能分子的多樣性的應(yīng)用潛力無限而被看好,木聚糖及其衍生物最有可能產(chǎn)生的重要的應(yīng)用便是藥物載體、傷口敷料以及造紙業(yè)中的添加劑。另外,木聚糖在食品中可用作乳化劑及膳食纖維,具有促進(jìn)有絲分裂及免疫調(diào)節(jié)等功能[11、12]。文中以玉米芯為原料,通過堿法抽提獲得木聚糖,由玉米芯所得的木聚糖經(jīng)過過氧化氫脫色,三氯乙酸脫蛋白,得到進(jìn)一步的純化,收得率較高,為后續(xù)用自提木聚糖酶解得到木寡糖提供了很好的原材料,簡化了為木寡糖的提取而需要的的純化步驟。并且通過對不同來源的木聚糖的米氏常數(shù)比較以及最適酶促反應(yīng)溫度的對比,表明從玉米芯提取所獲得的木聚糖具有一定的取代性。這一研究在可再生半纖維素資源的開發(fā)利用中具有重要意義。1材料和方法1.1木聚糖酶液的制備原料:玉米芯:河南,粉碎成直徑0.2mm及以下的顆粒。木聚糖酶液:發(fā)酵液8000×離心10min除去沉淀,上清液為木聚糖酶液。樺樹木聚糖(Sigma,X0502),山毛櫸木聚糖(Sigma,X4252),燕麥木聚糖(Sigma),鹽酸,3,5—二硝基水楊酸(DNS)溶液,乙酸,次氯酸鈉,氨水,氫氧化鈉,過氧化氫,三氯乙酸,乙醇。1.2儀器設(shè)備和分析方法SB-10A粉碎機(jī)速邦500g多功能粉碎機(jī);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司;HH-2恒溫水浴鍋金壇市科興儀器廠;152型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器金壇市科興儀器廠;FD-1D-50冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司。1.3方法1.3.1木聚糖的提取將玉米芯烘干后粉碎成0.2mm大小左右的顆粒,稱取40g玉米芯加入400ml蒸餾水,120℃高溫預(yù)處理30min,過濾取濾渣,將濾渣烘干后,加入400ml15%(w:v)的氫氧化鈉溶液,110℃高溫蒸煮30min,過濾取濾液,將濾液用30%(w:v)的氫氧化鈉做脫色處理,脫色后加入10%(w:v)的三氯乙酸溶液(10:1)脫蛋白,10000r/min離心20min,取上清液,加入濃鹽酸調(diào)pH值至中性。加入三倍體積的無水乙醇溶液過夜醇沉,8000r/min離心20min得到沉淀即為粗提木聚糖,-20℃冷凍過夜后冷凍干燥得到較純的木聚糖。玉米芯木聚糖收得率%=所得玉米芯木聚糖(g)/原始玉米芯質(zhì)量(g)×100%。1.3.2燕麥木聚糖-磷酸緩沖液的制備3.測試米氏常數(shù)的方法以燕麥木聚糖為例,其他木聚糖米氏常數(shù)的測定方法與其一樣(其中自提玉米芯木聚糖中使用的濃度是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%):樣品測定:用移液器吸取1.8ml的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%的燕麥木聚糖-磷酸緩沖液,分別打入1支干凈的具塞試管,置于電控恒溫水箱中,60℃恒溫下預(yù)熱兩分鐘,加入0.2ml粗酶液,充分混勻,準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘,再加入3mlDNS,充分混合,置沸水中煮沸5分鐘,然后迅速用冷水將其冷卻至室溫,在540nm下以空白樣對照測定吸光值。每種濃度的燕麥木聚糖-磷酸緩沖液做3個平行實(shí)驗。結(jié)果取其平均值。1.3.3粗酶液用量的確定樣品測定:用移液器吸取1.8ml的0.5%樺樹和自提玉米芯木聚糖—磷酸緩沖液,分別打入1支干凈的具塞試管置于電控恒溫水箱中,加入0.2ml粗酶液充分混勻,分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘后,拿出再加入3mlDNS,充分混合,置沸水中煮沸5分鐘,然后迅速用冷水將其冷卻至室溫,在540nm下以空白樣對照測定吸光值。每種溫度做3個平行實(shí)驗。結(jié)果取其平均值。2結(jié)果與分析2.1木聚糖的收得率40g玉米芯最后得到木聚糖的總量是9.77g,所以自提玉米芯木聚糖的收得率為24.4%,較高的收得率對以后工業(yè)上大量的獲得木聚糖有著重要的意義。2.2木聚糖在各種溶劑中的溶解未脫色未脫蛋白得到的自提玉米芯木聚糖顏色相對要深一些,而且后來在配制木聚糖溶液時,未經(jīng)任何處理的木聚糖基本不能完全溶解,在溶液中有細(xì)小的懸浮顆粒,而經(jīng)脫蛋白脫色后的可以完全溶解成乳白色的木聚糖溶液,和從sigma購買的樺樹木聚糖配制出來的溶液就外觀上看基本一致。由后續(xù)實(shí)驗結(jié)果也可知性質(zhì)上也是相似的,具有可替代性。2.3聚糖背后的底物和提玉米芯木聚糖的關(guān)系木聚糖酶對以燕麥木聚糖為底物測得的Km是5.6044,以山毛櫸木聚糖為底物測得的Km是4.1737,以樺樹木聚糖為底物測得的Km是3.6273,以自提玉米芯木聚糖為底物測得的Km是7.5302?？梢钥闯鲎蕴嵊衩仔灸揪厶敲资铣?shù)7.5312與燕麥木聚糖的5.6044比較相近。說明自提木聚糖雖然有雜質(zhì),但是依然具有一定的取代性,對那些只是用來做酶的性質(zhì)比較的實(shí)驗,可以用其替代需要購買的比較昂貴的木聚糖。2.4試驗對比用sigma的樺樹木聚糖和自提玉米芯木聚糖檢測DSM10635木聚糖酶的最佳酶促反應(yīng)溫度的試驗,見圖1。從