堿性磷酸酶km實(shí)驗(yàn)報(bào)告

竭誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)文檔/雙擊可除堿性磷酸酶km實(shí)驗(yàn)報(bào)告篇一：堿性磷酸酶Km值得測(cè)定(1)堿性磷酸酶Km值得測(cè)定原理在適宜條件下，酶促反應(yīng)的初速度隨底物濃度【s】增大而增大，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)一定時(shí)則反應(yīng)趨于穩(wěn)定，反應(yīng)速度最大。關(guān)系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常數(shù)。將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程對(duì)1/s作圖可算出Km步驟，以1/V結(jié)果由y=9.2961x+1.1465算出當(dāng)y=0時(shí)x=-0.233，繼而算出Km值=8.11mmol/L討論計(jì)算出來的Km值與查資料所得到的值有一定的差距。1 8誤差，所以導(dǎo)致與實(shí)際值差距較大。尿蛋白定性檢測(cè)原加熱可以使蛋白質(zhì)變性溶液ph等于pI時(shí)溶解度最小。步驟1.取大試管一支，加入5ml澄清尿液。2.用試管夾持試管上端，酒精燈加熱尿液斜面至沸(堿性磷酸酶km實(shí)驗(yàn)報(bào)告)3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面輕輕混勻局部加熱。結(jié)果未加熱部分是澄清，加熱部分渾濁明顯討正常尿液中不會(huì)出現(xiàn)渾濁，本實(shí)驗(yàn)?zāi)蛞杭尤肓说鞍踪|(zhì)。尿液中如果出現(xiàn)沉淀則說明出現(xiàn)了病癥。分子篩層析（凝膠過濾法）原理大分子先出，小分子后出。步驟1.取5~8滴4mg/ml藍(lán)色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重鉻酸鉀液混勻。2 82.將層析柱出水口打開，緩放柱內(nèi)液體至凝膠柱表面加入混勻的待層析液。3.從上成2~3cm高水4.在上口加洗脫液洗脫。每支小試管接1cm5.觀察不同小試管的液體顏色的變化。結(jié)果討論分子篩層析能夠大致的分離分子量不同的物質(zhì)，但是分離的物質(zhì)不純有雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)，操作復(fù)雜。篇二：實(shí)驗(yàn)名稱堿性磷酸酶的分離純化實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱堿性磷酸酶的分離純化、比活性測(cè)定與動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)日期20XX年10月25號(hào)實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)生化實(shí)驗(yàn)室合作者指導(dǎo)老師總分教師簽名批改日期堿性磷酸酶（AKp或ALp）是一種底物特異性較低，在堿性條件下能水解多重磷酸單脂化合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。AKp具有磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移活性，能將底物中的磷受體是水則其作用就是水解AKp最適ＰＨ范圍為８.６－１０，動(dòng)物中AKp主要存在于小腸粘膜、腎、骨骼、肝臟和3 8胎盤等組織的細(xì)胞膜上。血清AKp主要來自肝，小部分來自骨骼。AKp可從組織中分離純化，也可以采用基因工程表達(dá)的方式獲得：將堿性磷酸酶基因克隆到重組載體，轉(zhuǎn)入宿主菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并從表達(dá)菌提取，并進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析。一實(shí)驗(yàn)原理1、堿性磷酸酶的分離純化AKp分離純化的方法與一般蛋白質(zhì)的分離純化方法相似，分離AKp。正丁醇能使部分雜蛋白變性，過濾除去雜蛋白即為含有AKp的濾液，AKp能溶于終濃度為33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于終濃度為50%的丙酮或60%的乙醇中，通過離心即可得到初步純化的AKp。2、堿性磷酸酶的比活性測(cè)定根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，酶的比活性用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性來表示，單位（u/mg?pr）來表示。因此，測(cè)定樣品的比活性必須測(cè)定a每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)；b每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。酶的純濃度越高酶的比活性也就越高。本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解生成游離酚和磷酸鹽酚在堿性條件下與4-氨基安4 8淺和酚的含量成正比。于510nm處比色，即可求出反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酚含量而堿性磷酸酶的活性單位可定義為在37攝氏度保溫15min每產(chǎn)生1mg的單位。品蛋白質(zhì)含量測(cè)定用Folin-酚法測(cè)定。3、底物濃度對(duì)堿性磷酸酶活性的影響在環(huán)境的溫度、ＰＨ和酶的濃度一定時(shí)，酶促反應(yīng)速度（Vmax程式表示：式中Vmax為最大反應(yīng)速度[s]為底物濃度Km為米氏常數(shù)V代表反應(yīng)的起始速度①當(dāng)ν=Vmax/2時(shí)Km=[s]。因此Km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度。②Km是酶的最重要的特征性常數(shù)，測(cè)定Km值是研究酶動(dòng)力學(xué)的一種重要的方法，大多數(shù)酶的Km值在0.01-100mmol/L。③Km和Vmax的測(cè)5 8用Lineweaver-burk雙倒數(shù)作圖法。此式為直線方程，以不同的底物濃度1/s坐標(biāo)，以1/V將各點(diǎn)連成一直線，向縱軸方向延長(zhǎng)，此線與橫軸相交的負(fù)截距為-1/Km，由此可以正確球的該酶的Km值。方程式與圖如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，測(cè)定不同底物濃度時(shí)的酶活性，再根據(jù)Lineweaver-burk法作圖計(jì)算其Km值。實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用鉀氧化生成紅色的醌衍生物上差得酚的含量，進(jìn)而算出酶活性的大小。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）堿性磷酸酶的分解純化和比活性測(cè)定１、樣品兔肝２、試劑①0.5mol/L乙酸鎂溶液②0.1mol/L乙酸鈉溶液③0.01mol/L乙酸鎂0.01mol/L乙酸鈉溶液④0.01mol/LTris－0.L乙酸鎂ph８.８緩沖液⑤丙酮（分析純）⑥95%乙醇（分析純）⑦正丁醇（分析純）⑧0.04mol/L１mg/ml分標(biāo)準(zhǔn)液⑩0.5mol/LＮａＯ6 8?0.3%4－氨基安替比?0.5%鐵氰化鉀?0.1mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液?堿性銅試劑?酚試劑３、儀器與器材①研缽②刻度離心管③刻度吸管④電動(dòng)離心機(jī)⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盤天平⑦恒溫水?、嗫梢姺止夤舛扔?jì)（二）底物濃度對(duì)堿性磷酸酶活性的影響１、樣品兔肝勻漿液２、試劑①0.04mol/L底物液②0.1mol/L碳酸鹽緩沖液ph10（37℃）③堿性溶液④0.5%鐵氰化鉀0.3%4－氨基安替比林⑥酚標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml）３、儀器與器材①恒溫水浴鍋②可見光分光光度計(jì)三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）AKp的提取AKp提取實(shí)驗(yàn)步驟(二)AKp的比活性測(cè)定1、AKp的活性測(cè)定7 8AKp活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟2、蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定實(shí)