高密度固體發(fā)酵白酒糟的研究

高密度固體發(fā)酵白酒糟的研究

白酒灰是酒精生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品。中國每年約有2000萬噸新鮮白酒灰，相當于600萬噸干酒灰。白酒糟水分大,酸度高,易腐爛變質(zhì),不易保管和運輸,且其中含有50%左右難于消化的稻殼,直接飼喂效果欠佳。因此,目前絕大多數(shù)白酒糟都以低廉價格作為粗飼料,部分作為廢棄物任意堆放,嚴重污染環(huán)境。我國是一個飼料蛋白資源嚴重短缺的大國,每年需從國外進口大量豆粕、魚粉等以填補國內(nèi)市場的不足。基于此,本研究以白酒糟為基質(zhì)進行酵母細胞的高密度固體發(fā)酵,通過提高白酒糟中的酵母細胞數(shù)量,既可充分利用白酒糟,減少它對環(huán)境的污染,又可提高其營養(yǎng)價值,使之成為新型的蛋白飼料,創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟價值,從而更好地滿足養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)牧業(yè)的需求,具有十分重要的現(xiàn)實意義。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1病毒釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室保藏。1.1.2復合酶制劑濃度固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:將白酒糟于60℃烘48h,過60目篩,向其中添加適量復合酶制劑。其中復合酶制劑由武漢新地生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供,白酒糟由湖北十堰白泉酒業(yè)有限公司提供。酵母菌活化培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基;酵母菌平板計數(shù)培養(yǎng)基:YPD固體培養(yǎng)基。1.2實驗方法1.2.1母細胞激活法挑取酵母菌一環(huán),接種于200ml的YPD液體培養(yǎng)基中28℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)24h,得到活化好的酵母菌懸液備用。1.2.2計算螺母細胞的方法酵母菌生長曲線的測定:稀釋涂平板計數(shù)法;酵母細胞總數(shù)的測定:顯微鏡血球計數(shù)板直接計數(shù)法。1.2.3固體發(fā)酵條件的優(yōu)化1.2.3.酵母菌種發(fā)酵250ml三角瓶中分別裝入干酒糟5、10、15、20g,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,接種活化后的酵母菌液,接種量為1億/g干酒糟,控制料水比為1:1,搖勻,封口膜封口后于30℃恒溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)周期為72h,自然pH值。自發(fā)酵起始每隔12h翻料一次至發(fā)酵結(jié)束。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定裝料量。1.2.3.復合酶制劑添加量的確定選取裝料量10g,按干糟質(zhì)量的1%、2%、3%、4%、5%添加復合酶制劑,并設(shè)不加復合酶制劑的對照,其余條件不變。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定復合酶制劑添加量。1.2.3.調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量選取裝料量10g,加入干酒糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%,其余條件不變。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定初始水分。1.2.3.固體基質(zhì)接種量選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,按0.1、0.3、0.5、0.7、1、2億/g固體基質(zhì)接種量接入活化后的酵母懸液,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,其余條件不變。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定接種量。1.2.3.初始ph值對養(yǎng)基回收率的影響選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,以稀硫酸和CaO調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0,對照組為自然pH值組(CK),接種量0.7億/g干酒糟,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,其余條件不變。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定初始pH值。1.2.3.發(fā)酵溫度對酵母總菌數(shù)的影響選取裝料量10g,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,自然pH值,接種量0.7億/g干酒糟,調(diào)整培養(yǎng)基初始含水量為45%,分別在25、28、30、37℃的發(fā)酵溫度下,發(fā)酵84h,每隔12h測定酵母總菌數(shù),其余條件不變。每組設(shè)3個平行,以血球計數(shù)法所得酵母總數(shù)為指標確定最適培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。1.2.4固液體發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化1.2.4.無機氮源添加量本實驗選用淀粉和糖蜜作為碳源,設(shè)定碳源添加量為8%(w/w);選用NH4Cl、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素作為無機氮源,胰蛋白胨作為有機氮源,設(shè)定氮源添加量為0.5gN/kg干糟。外加碳、氮源均配置成一定濃度的混合營養(yǎng)液,向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中等體積補加進去,搖勻分散,按照優(yōu)化后的固體發(fā)酵條件培養(yǎng)至72h。每組設(shè)3個平行,以發(fā)酵結(jié)束后酵母總數(shù)為指標確定所添加碳、氮源的種類。1.2.4.糖蜜、尿素的添加量對高密度發(fā)酵的影響向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相同體積(設(shè)定為2ml)不同濃度的糖蜜和尿素混合液(見表1),按照優(yōu)化后的固體發(fā)酵條件培養(yǎng)至72h,研究不同的糖蜜、尿素添加量對酵母高密度發(fā)酵的影響,設(shè)計兩因素四水平的正交實驗表,以酵母總數(shù)為指標進行正交實驗。2結(jié)果與分析2.1優(yōu)化固發(fā)條件2.1.1裝料量對酵母生長的影響裝料量可在一定程度上影響酵母的生長。裝料量少,水分蒸發(fā)快,不利于酵母微環(huán)境穩(wěn)定,而且設(shè)備利用率較低;裝料量多,透氣性差,不利于氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸,而且會出現(xiàn)酒糟中心溫度過高的現(xiàn)象。試驗結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出,裝料量過低或過高都對酵母生長不利,當裝料量為10g時,酵母生長較好。因此選擇最適裝料量為250ml三角瓶裝10g。2.1.2酵母質(zhì)降解實驗復合酶制劑中含有β-葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶等,可以將酒糟中的纖維素、淀粉類物質(zhì)降解,有利于酵母對酒糟中難以自行利用的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,有利于酵母的快速生長繁殖。實驗結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出,在酒糟中添加復合酶制劑的效果非常明顯,添加復合酶制劑與不添加的對照組差異很大,但當添加量為4%~5%時,變化不大。為節(jié)約成本,選用最適添加量4%。2.1.3酒糟含水量對酵母菌生長的影響培養(yǎng)基含水量是影響固態(tài)發(fā)酵結(jié)果的主要因素之一。基質(zhì)水分含量過低,會減緩和妨礙菌體生長繁殖;基質(zhì)水分含量過高,會造成供氧不足,同樣影響菌體生長,只有基質(zhì)含水量適中時,酵母生長才比較旺盛。實驗結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,當酒糟含水量從40%~60%變化時,酵母數(shù)量先增加后減少,當含水量在45%~50%時,酵母菌數(shù)約為17億/g干糟。因此選擇最適含水量45%~50%。2.1.4接種量對酵母菌多樣性的影響接種量與培養(yǎng)基的利用率直接相關(guān),接種量大會加速營養(yǎng)物質(zhì)的利用,縮短生長周期;接種量太少,不能充分利用營養(yǎng)物質(zhì),而且會導致發(fā)酵周期延長,從而提高染菌的概率。實驗結(jié)果如圖4所示,當接種量為0.7億/g干酒糟時,酵母總數(shù)約18.9億/g干糟。因此選擇最適接種量為0.7億/g干酒糟。2.1.5初始ph值對酵母菌生長的影響pH值是決定微生物生長狀況的重要因素之一。酵母菌能在pH值為3~8.5的范圍內(nèi)生長,最適pH值為4.5~5.0。pH值可影響酵母細胞膜通透性、細胞內(nèi)酶活、營養(yǎng)物質(zhì)的存在狀態(tài)以及酵母對其吸收等,對酵母生長的影響較大。適宜的酸堿度有利于酵母生長,酵母的代謝活動也會影響環(huán)境pH值。實驗結(jié)果見圖5。從圖5中看出,自然pH值下酵母總數(shù)為19.1億/g干糟,經(jīng)測定,該酒糟自然pH值為3.6。隨著pH值的增高,酵母數(shù)量在減少。酵母之所以會在初始pH值低于4.5的培養(yǎng)基中生長良好,是因為在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基的pH值會增高(經(jīng)測定發(fā)酵終點的pH值為6.5左右),所以初始pH值適當?shù)鸵恍┯欣诮湍傅母呙芏劝l(fā)酵培養(yǎng)。因市場上大部分酒糟初始pH值均偏酸,選擇自然pH值,也有利于實際生產(chǎn)應用。2.1.6發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期溫度的高低直接影響酵母的生長。溫度過低,酵母只在基質(zhì)中下層生長,溫度過高只在基質(zhì)表面生長且會殺死菌種,同時,培養(yǎng)溫度和時間具有相關(guān)性。實驗結(jié)果見圖6,從圖6中可以看出,在溫度為30℃時,酵母在各個時間段的生長都最好,據(jù)此酵母培養(yǎng)溫度選用30℃。同時可以看出,在48h之前酵母增加比較快,48h之后雖然也在增加,但是趨勢變緩,72h達到最高峰,此后酵母數(shù)量開始下降。因此初步確定發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵周期為72h。從以上實驗得到釀酒酵母高密度發(fā)酵白酒糟的最適發(fā)酵條件為:250ml三角瓶裝入干白酒糟10g,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,按0.7億/g干糟的量接入活化后的酵母,調(diào)整酒糟的含水量為45%~50%,自然pH值,封口膜封口后于30℃恒溫箱中發(fā)酵培養(yǎng)至72h結(jié)束。此時酵母數(shù)量可達到19.8億/g干糟。2.2固液體發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化在菌體生長中后期由于營養(yǎng)不足、碳氮源不平衡、微量元素缺乏,菌體會過早衰老。因此有必要向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補入一定的營養(yǎng)物質(zhì)。2.2.1添加糖蜜、氮源、尿素對酵母菌生長的影響碳源是氮源微生物生長菌體時需要量最大的物質(zhì),在發(fā)酵前期消耗很快,到了中后期,菌體要維持活性必須外加一定量的碳氮源,以延緩菌體衰老。實驗結(jié)果如圖7、圖8所示。從圖7中可以看出,在外加碳源中,添加糖蜜的實驗組生長較好,分析原因可能是因為糖蜜作為制糖的主要副產(chǎn)物,總糖分為50%左右,它不僅含有酵母生長可直接利用的碳源,還含有微量元素及維生素等多種成分,可促進酵母生長;在外加氮源中,添加尿素的實驗組生長較好,它的主要作用是調(diào)節(jié)pH值和補充酵母菌生長所需氮源,從而控制代謝活動。這和姚曉紅等的研究結(jié)果一致。據(jù)此確定最適碳、氮源分別為糖蜜和尿素。2.2.2最優(yōu)發(fā)酵條件及工藝以補料種類中糖蜜和尿素添加量為基礎(chǔ),設(shè)計了2因素4水平的正交實驗。通過正交實驗L16(4)2找到糖蜜和尿素的最適添加量。正交實驗結(jié)果如表2所示。從表2看出糖蜜的補料量是對酵母高密度發(fā)酵影響較大的因素,其次為尿素添加量。理論上最佳添加量為A3B3,即糖蜜添加量8%(w/w干糟),尿素添加量0.5gN/kg干糟。按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行固態(tài)發(fā)酵,酵母總數(shù)達到30.3億/g干糟。這比只采用最佳發(fā)酵條件而未中間補料的工藝,酵母數(shù)量提高了53%左右。按最優(yōu)發(fā)酵條件及工藝進行平行實驗,所測得酵母總數(shù)分別為29.5、30.4、29.9億/g干糟,平均值為30億/g干糟,說明該優(yōu)化條件具有良好的重現(xiàn)性和可靠性。釀酒酵母高密度固態(tài)發(fā)酵白酒糟實驗室最佳發(fā)酵條件及工藝為:250ml三角瓶裝入干白酒糟10g,并補加混合營養(yǎng)液2ml(以干糟質(zhì)量的8%添加糖蜜,以0.5gN/kg干糟的量添加尿素),搖勻分散,加入干糟質(zhì)量4%的復合酶制劑,按0.7億/g干糟的量接入活化后的酵母,調(diào)整酒糟的含水量為45%~50%,封口膜封口后于30℃恒溫箱中發(fā)酵培養(yǎng),自發(fā)酵起始每隔12h翻料一次至72h固體發(fā)酵結(jié)束。最終酵母總數(shù)可達30億/g干糟。3復合酶制劑發(fā)酵及活性物質(zhì)含量白酒用高粱、玉米、小麥、稻谷、大麥等純糧單一原料或者混合原料發(fā)酵而成。白酒發(fā)酵主要是對原料中的淀粉轉(zhuǎn)化,對原料中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化利用較少,它們基本保存在酒糟中。根據(jù)有關(guān)文獻的分析測定,由于發(fā)酵的濃縮作用(原料淀粉被利用),酒糟的蛋白質(zhì)含量(干基)與原料相比,可以提高一倍以上,達到15%以上,除蛋白質(zhì)含量較高外,酒糟蛋白質(zhì)的氨基酸組成比較平衡,基本上是全價的;酒糟中礦物質(zhì)含量也很豐富,其中鈣、鐵等主要微量元素含量比較高;此外,還含有多種維生素,以及菌體自溶產(chǎn)生的各種生物活性物質(zhì)(如嘌呤、嘧啶、類脂化合物、酶類),具有生物轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量飼料的潛質(zhì),這也是本實驗中酵母得以快速生長繁殖的基礎(chǔ)。本研究僅在發(fā)酵初始階段