不同溫度環(huán)境下不同新鮮糞樣生殖激素檢測結(jié)果比較

不同溫度環(huán)境下不同新鮮糞樣生殖激素檢測結(jié)果比較

生殖激素與動物繁殖密切相關(guān)，并直接或間接地參與動物的繁殖和繁殖。生殖激素的活動指揮著生殖系統(tǒng)的發(fā)育,以實(shí)現(xiàn)繁殖后代的功能。一般情況下,動物機(jī)體內(nèi)的生殖激素含量在發(fā)情周期有著明顯的變化規(guī)律,通過檢測發(fā)情周期生殖激素含量的變化,可以了解和指導(dǎo)動物的繁殖活動。國內(nèi)外很多研究人員對野生動物糞樣生殖激素檢測與繁殖行為之間的關(guān)系做了大量研究,但是,野生動物糞樣保存的溫度對糞樣激素的檢測結(jié)果是否存在影響則少見報(bào)道。本文以雌性成年華南虎(Pantheratigrisamoyensis)的新鮮糞樣為試驗(yàn)對象,將在不同溫度環(huán)境中保存的糞樣,用CatELISAKit檢測糞樣中雌二醇(E)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的濃度,并分析環(huán)境溫度對糞樣中糖蛋白激素和類固醇激素的影響,為野生動物的糞樣采集和保存提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1elisa試劑盒21份新鮮糞便樣品均采自福州動物園1只雌性成年健康華南虎排泄的糞便。ELISA試劑盒(CatEELISAKit,CatPROGELISAKit,CatLHELISAKit,CatFSHELISAKit)購自森貝伽生物公司。1.2方法1.2.1糞樣的采集和預(yù)處理將不同日期采集的7份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內(nèi)及時(shí)分裝2管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。每份糞樣各取1管直接真空冷凍干燥凍干24h(A組)。每份糞樣的另1管先置于-20℃冰箱保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h(B組),待測。將不同日期采集的4份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內(nèi)分裝4管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。每份糞樣分別置于25℃(C組),4℃(D組),-20℃(E組),-70℃(F組)保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h,待測。將不同日期采集的5份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內(nèi)分裝5管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。將5份糞樣(G組～K組)置于-20℃保存,保存期9d。在保存期內(nèi)每隔1d取1管真空冷凍干燥凍干24h,待測。將不同日期采集的5份新鮮糞樣,每份糞樣采集后1h內(nèi)分裝5管清潔干燥的西林瓶中,每管2g,編號。將5份糞樣(L組～P組)置于4℃保存,保存期9d。在保存期內(nèi)每隔1d取1管真空冷凍干燥凍干24h,待測。上述凍干的糞樣用研缽研細(xì),過篩去除雜質(zhì)。用電子秤稱取0.1g裝入2mL和10mL的離心管中,分別用于測定糖蛋白激素(卵泡刺激素和黃體生成素)和類固醇激素(雌二醇和孕酮)。1.2.2提取激素1.2.2.離心水浴將裝有0.1g糞樣的10mL離心管內(nèi)加入5mL90%乙醇,振蕩至固液充分混合,2400r/min離心10min。置于90℃水浴20min,振蕩均勻。2400r/min離心20mim,將上清液移入10mL離心管。重復(fù)上一步驟,2400r/min離心20mim,取上清液1mL,置于真空烘箱50℃烘干,加入1.5mLPBS沉淀,待測。1.2.2.離心管的制備將裝有0.1g糞樣的2mL離心管內(nèi)加入1.5mL0.9%NaCl,振蕩至固液充分混合,3000r/min離心20min,取上清液至10mL的離心管。重復(fù)上一步驟,3000r/min離心20min,取上清液待測。1.2.3elisa東南角兩大細(xì)胞菌中he,p,cat的表達(dá)將待測樣品用ELISA方法檢測,OD450nm處讀值。CatEELISAKit測定雌二醇(E),CatPROGELISAKit測定孕酮(P),CatLHELISAKit測定黃體生成素(LH),CatFSHELISAKit測定卵泡刺激素(FSH)。1.2.4處理數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel數(shù)據(jù)處理,SPSS1l.5進(jìn)行Paired-SamplesTTest和One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1生成素測定結(jié)果直接冷凍干燥(A組)和置于-20℃保存24h后冷凍干燥(B組)的糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素測定結(jié)果見表1。Paired-SamplesTTest分析結(jié)果表明,2種保存方法對糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量影響甚微,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,兩者間差異均不顯著(P>0.05)。2.2糞樣中生成素測定25℃(C組),4℃(D組),-20℃(E組)和-70℃(F組)條件下保存24h后,真空冷凍干燥凍干24h的糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結(jié)果見表2。One-WayANOVA分析結(jié)果表明,雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素在25℃,4℃,-20℃和-70℃溫度條件下保存,差異均不顯著(P>0.05)。2.3生成素測定結(jié)果-20℃保存的糞樣,保存第1天(G組),第3天(H組),第5天(I組),第7天(J組)和第9天(K組)真空冷凍干燥凍干24h后雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結(jié)果見表3。One-WayANOVA分析結(jié)果表明,華南虎糞樣在-20℃下保存9d內(nèi)雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素均無顯著差異(P>0.05)。2.44生成素測定結(jié)果4℃保存的糞樣,保存第1天(L組),第3天(M組),第5天(N組),第7天(0組)和第9天(P組)真空冷凍干燥凍干24h后雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素含量測定結(jié)果見表4。One-WayANOVA分析結(jié)果表明,華南虎糞樣在4℃下保存9d內(nèi)雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素均無顯著差異(P＞0.05)。3氣體、局部和生成素檢測張洪海等人利用放射性免疫分析法(RIA)檢測東北虎糞樣中雌二醇和睪酮含量,將新鮮糞樣置于-20℃保存。于鴻浩等人建立了糞樣中激素的提取和高效液相色譜測定的方法,將采集的藏羚羊(TibetanAntelope)的新鮮糞便置于-80℃保存。崔媛媛等認(rèn)為,一般情況下,糞樣保存溫度建議為4℃或-20℃。郎冬梅利用ELISA檢測林麝(Moschusberezovskii)糞樣中的孕酮的含量,結(jié)果表明孕酮在室溫保存數(shù)小時(shí)內(nèi)會呈上升趨勢,之后會呈下降趨勢。本研究將雌性華南虎新鮮糞樣置于4個(gè)不同溫度(25℃,4℃,-20℃和-70℃)保存24h,檢測糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素,結(jié)果表明,各處理間均無明顯差異。研究結(jié)果與前人的觀點(diǎn)存在差異,其原因可能與檢測的方法和測定條件不盡相同所致。迄今,糞樣處理最簡便易行的方法是使用真空冷凍干燥機(jī)(-60℃,24h)進(jìn)行冷凍干燥。雖然已有研究表明,糞樣保存的濕度比溫度影響小,以及干燥糞樣與冷凍儲藏糞樣生殖激素含量有較顯著的相關(guān)性。本研究將雌性華南虎新鮮糞樣分別做直接凍干和保存于-20℃后再凍干,糞樣中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素兩者間無明顯差異。將雌性華南虎新鮮糞樣-20℃保存9d和4℃保存9d,兩者糞樣中雌二