小葉蓮提取物抗乳腺癌活性研究

小葉蓮提取物抗乳腺癌活性研究

小葉蓮?fù)ǔＪ且环N藏藥。這是一種干燥、成熟的水果。它不僅具有活血調(diào)經(jīng)的功能，還具有明顯的腫瘤活性。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小葉蓮乙醇提取物(X1)以及主要成分8,2’-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚(S1)對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用。為此,擬繼續(xù)對(duì)X1、小葉蓮的乙酸乙酯提取物(X2)、小葉蓮正丁醇提取物(X3)以及小葉蓮主要成分S1和槲皮素(S2)進(jìn)行體內(nèi)、外抗乳腺腫瘤活性研究,旨在闡明小葉蓮抗乳腺癌活性作用和其物質(zhì)基礎(chǔ),為新藥研發(fā)和臨床用藥提供依據(jù)。其中,小葉蓮不同極性提取物和異戊烯基黃酮類化合物的體內(nèi)抗乳腺腫瘤研究尚屬首次報(bào)道。1材料表面1.1流式細(xì)胞術(shù)和酶標(biāo)儀超凈工作臺(tái)(北京偉達(dá)凈化廠);CP214型電子天平(美國(guó)Ohaus公司);培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BDPharmingen公司);VersaMax型酶標(biāo)儀(美國(guó)MolecularDevices公司);CKX31型倒置顯微鏡(日本Olympus公司);96孔板(美國(guó)CorningCostar公司)。1.2晶珠藏藥公司小葉蓮,2009年10月購(gòu)于青海晶珠藏藥公司,產(chǎn)地為青海,憑證標(biāo)本(編號(hào):6339)存放于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院生藥標(biāo)本室。1.3培養(yǎng)基和胎牛血清環(huán)磷酰胺(CTX,美國(guó)AcrosOrganics公司,批號(hào):A1064185);碘化丙錠(PI)、磺酰羅丹明B、核糖核酸酶RNase(美國(guó)Sigma公司);1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均為分析純,購(gòu)自北京化工廠。1.4[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證]scxkBalb/c裸小鼠,♀,4~6周齡,體質(zhì)量(19.0±2.5)g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SCXK(京)2011-0012]。人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥劑學(xué)系呂萬(wàn)良教授惠贈(zèng)。2方法2.1凍干粉的制備取小葉蓮干燥藥材17.5kg,粉碎為粗粉,以8倍量的95%乙醇回流提取2次,每次2h,50%乙醇提取1h,提取液合并后濃縮至基本無(wú)醇味,得到4.17kgX1。取4.01kgX1,加蒸餾水12L至完全懸浮后,依次用等倍體積乙酸乙酯、水飽和正丁醇各提取5次。提取液分別減壓回收溶劑,得各提取物。其中,X2為深棕色浸膏1150.0g,X3為紅棕色浸膏794.8g。分別取X1、X2、X3各10g,制成凍干粉,備用。每1gX1相當(dāng)于原生藥4.19g,每1gX2相當(dāng)于原生藥14.5g,每1gX3相當(dāng)于原生藥20.9g。S1和S2為筆者從小葉蓮中分離得到并經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定,二者純度>98.0%。2.2dmso貯備液和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用2.2.1小葉蓮提取物溶液的制備取X1、X2、X3凍干粉適量,以蒸餾水制備成質(zhì)量濃度為100mg/ml的蒸餾水貯備液(供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用);以DMSO制備成質(zhì)量濃度為10mg/ml的DMSO貯備液(供體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用)。2.2.2S1和S2溶液的制備取S1和S2適量,以0.5%CMC-Na制備成質(zhì)量濃度為1.5mg/ml的0.5%溶液(供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用);以DMSO制備成濃度為10μmol/ml的DMSO貯備液(供體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用)。2.3細(xì)胞內(nèi)添加dmso人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231復(fù)蘇后,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞以200μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板,每孔8000個(gè)細(xì)胞。貼壁生長(zhǎng)24h后給藥。制備4種質(zhì)量濃度的X1、X2、X3溶液(1、25、50、100μg/ml)和4種濃度的S1和S2溶液(12.5、25、50、100μmol/L)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48h取出培養(yǎng)板,每孔加入10%(m/V)的三氯乙酸(TCA)100μl固定細(xì)胞,4℃放置1h。棄固定液,用蒸餾水洗滌5次,空氣中自然干燥,每孔加磺酰羅明B溶液100μl,室溫下放置10~30min。用1%醋酸洗滌5次,自然干燥。最后加入150μl/孔Tris溶液,在平板振蕩器上振蕩5min。用酶標(biāo)儀在515nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD),用空白對(duì)照調(diào)零。以細(xì)胞內(nèi)加DMSO作模型對(duì)照。按下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率:抑制率=(OD模型對(duì)照-OD給藥)/OD515模型對(duì)照×100%。2.4小葉蓮提取物對(duì)蓮花腫瘤大鼠mcf-7移植瘤的抑制作用2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布,后以LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1人乳腺癌細(xì)胞對(duì)mb-33的抑制作用X1、X2可較強(qiáng)抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,X3的抑制作用較弱,3種提取物的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為39.51、55.18、89.10μg/ml。X1、X2、X3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制作用較弱,IC50分別為101.70、96.09、196.00μg/ml。S1、S2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7有較強(qiáng)抑制作用,IC50分別為17.67、39.87μmol/L;S1、S2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制作用較弱,IC50分別為36.33、58.76μmol/L。小葉蓮提取物、S1、S2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用分別見(jiàn)表1、表2。3.2被模型1對(duì)荷瘤小鼠mcf-7移植瘤體積的抑制作用與模型組比較,X1組、X2組、X3組、S1組、S2組荷瘤小鼠MCF-7移植瘤質(zhì)量減輕,瘤質(zhì)量抑制率明顯升高(P<0.01或P<0.05)。S1、S2對(duì)荷瘤小鼠MCF-7移植瘤體積的抑制作用相似。與模型組比較,第3~6天,S1組瘤體積抑制率大于CTX組及S2組;第6~9天,模型組移植瘤體積繼續(xù)增長(zhǎng),而S1組移植瘤體積未增大,S2組移植瘤體積減小。X1、X2、X3對(duì)荷瘤小鼠MCF-7移植瘤的抑制作用分別見(jiàn)表3、表4;S1、S2對(duì)荷瘤小鼠MCF-7移植瘤質(zhì)量、體積的抑制作用分別見(jiàn)表5、表6。4黃酮類化合物X1、X2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231以及荷瘤小鼠移植瘤有較強(qiáng)的抑制作用,與其主要成分為木質(zhì)素和黃酮有關(guān)。而X3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231以及荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用均較弱,可能因?yàn)閄3雖然含有黃酮苷和木脂素苷類化合物,但同時(shí)含有大量大分子物質(zhì),掩蓋了其活性,因此抗腫瘤作用不明顯。黃酮類化合物被認(rèn)為具有植物雌激素作用以及線粒體毒性,具有較好的抗腫瘤活性。S1對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用強(qiáng)于S2,可能是因?yàn)楫愇煜┗〈?。而S2為S1的黃酮母核,對(duì)于多種細(xì)胞株在體內(nèi)、外均有較好的抑制作用,從而證明研究S1的體內(nèi)、外抗腫瘤活性有一定意義。乳腺癌為女性常見(jiàn)腫瘤之一,目前運(yùn)用類雌激素替代治療越來(lái)越受到重視。而黃酮類化合物具有類雌激素的生物活性,并且對(duì)乳腺癌有抑制作用。通過(guò)比較S1和S2對(duì)激素依賴型人乳腺癌細(xì)胞株體外細(xì)胞增殖抑制作用以及對(duì)裸小鼠移植瘤的抑制作用,初步得出結(jié)論:具有異戊烯基取代的黃酮類化合物不僅在離體實(shí)驗(yàn)中活性較好,同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也有較好的活性,推測(cè)與異戊烯基黃酮的類雌激素作用相關(guān)。從傳統(tǒng)醫(yī)藥中尋找具有活性的天然產(chǎn)物作為先導(dǎo)化合物是創(chuàng)新藥物的研究方向之一。本研究結(jié)果可為小葉蓮的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。2.4.1模型的復(fù)制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7復(fù)蘇后,置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d傳代培養(yǎng)。將貼壁細(xì)胞用PBS洗2次,用0.25%胰酶消化,1640培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化后,吹打成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),離心收集,PBS洗2次,離心收集。加入PBS,使細(xì)胞密度為5×107ml-1,每只裸小鼠腋下注射200μl。正常喂養(yǎng)4d后,裸小鼠腋下長(zhǎng)出腫瘤塊。處死裸小鼠,無(wú)菌操作下取瘤塊,除去邊緣壞死組織部分。將取下的瘤塊以相同大小(3mm3)包埋于每只裸小鼠右側(cè)腋窩皮下。2.4.2分組與給藥(1)X1對(duì)荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實(shí)驗(yàn)分為3組,即模型組(等容生理鹽水)組、X1(500mg/kg)組、CTX(15mg/kg)組。復(fù)制模型第2天后ig給藥,每天1次,連續(xù)15d。末次給藥1d后處死小鼠,先稱體質(zhì)量,后解剖皮下瘤塊,稱瘤質(zhì)量。裸小鼠實(shí)際體質(zhì)量為所稱體質(zhì)量減去瘤質(zhì)量。計(jì)算瘤質(zhì)量抑制率[瘤質(zhì)量抑制率(%)=(1-用藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量)×100%]。(2)X2、X3對(duì)荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實(shí)驗(yàn)分為4組,即模型(等容生理鹽水)組、X2(500mg/kg)組、X3(500mg/kg)組、CTX(15mg/kg)組。給藥與指標(biāo)檢測(cè)同“2.4.2(1)”項(xiàng)下方法。(3)S1和S2對(duì)荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實(shí)驗(yàn)分為4組,即模型組(等容生理鹽水)組、S1