番木瓜組織培養(yǎng)與環(huán)斑病毒病的抗性研究

番木瓜組織培養(yǎng)與環(huán)斑病毒病的抗性研究

番木瓜的植株復(fù)雜，遺傳高度混合。很難通過傳統(tǒng)的育種方法保持相同的植株性。同時(shí)，番木瓜環(huán)境病病從多年生持續(xù)到一級(jí)，極大地限制了番木瓜的生產(chǎn)和利用。通過組織培養(yǎng)進(jìn)行無性系快速繁殖可以解決,在種苗商業(yè)化生產(chǎn)中已進(jìn)入應(yīng)用階段。1材料和方法1.1外植體的選擇、檢測(cè)和預(yù)處理從田間成年健壯番木瓜植株上剪取生長有頂芽和側(cè)芽的旺盛分枝,切除多余枝條部分,去掉葉片、葉柄,放入保鮮袋。1.2消毒外植體的決定1.2.1山農(nóng)政監(jiān)獄培養(yǎng)的篩選自來水沖洗10min→飽和肥皂水浸泡20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→4%次氯酸鈉12min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.2.2山農(nóng)政民間培養(yǎng)基的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞10min→4%次氯酸鈉8min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.2.3接種水生物膜的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞10min→無菌水沖洗4次→消毒的濾紙上吸干水分→接種到不含山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.2.4山農(nóng)政藥種的制備自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→0.1%升汞10min→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.2.5接種及接種方法自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→0.1%升汞10min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.2.6接種及接種方法自來水沖洗10min→飽和肥皂水20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農(nóng)一號(hào)溶液的培養(yǎng)基中。1.3培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L瓊脂。1.4培訓(xùn)條件培養(yǎng)室溫度25±2℃,光強(qiáng)1500lx,光周期12h,相對(duì)濕度60-80%。1.5材料的沖洗和接種供試材料“穗優(yōu)”細(xì)菌污染材料10瓶,每瓶1個(gè)外植體。先用無菌水沖洗材料,后用細(xì)頭尖鑷剔除粘附在外植體表面的細(xì)菌(物理清除),再用25mg/L的硫酸鏈霉素溶液(孔徑0.22μm的濾膜抽濾)浸泡清洗,最后將材料接種至含0.2%山農(nóng)一號(hào)的培養(yǎng)基中。2結(jié)果2.1綜合考慮消毒處理效果由表1可知:方法I、Ⅲ有較高的污染率,而Ⅱ與IV、V有較高的失活率;綜合考慮方法Ⅵ消毒處理效果較好,污染率11.11%,成活率77.78%。消毒后頂芽與側(cè)芽接種在MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基上,4-6周后形成小叢芽,沒有明顯的愈傷組織(圖1)。2.2外植體的拯救試驗(yàn)使用濃度25mg/L、經(jīng)抽濾滅菌(0.22μm濾孔)的硫酸鏈霉素對(duì)10瓶細(xì)菌污染外植體(圖1-e)進(jìn)行搶救,之后接種到含有0.2%“山農(nóng)一號(hào)”的培養(yǎng)基上。試驗(yàn)結(jié)果顯示8株外植體搶救成活,搶救成活率達(dá)80%,但對(duì)中、重度污染材料無能為力。因此,使用抗生素硫酸鏈霉素和抑菌劑山農(nóng)一號(hào)結(jié)合,對(duì)輕度細(xì)菌污染的珍貴外植體材料搶救十分有效。3硫酸鏈霉素pcr外植體的消毒處理試驗(yàn)結(jié)果表明番木瓜無菌培養(yǎng)體系的建立可用頂芽與側(cè)芽為外植體誘導(dǎo)叢芽,消毒方法為:自來水沖洗10min→飽和肥皂水浸泡20min→無菌水沖洗3次→75%酒精30s→無菌水沖洗3次→4%NaClO8min→無菌水沖洗4次→接種至含有0.2%山農(nóng)一號(hào)I型溶液的培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L瓊脂)。硫酸鏈霉素對(duì)于污染珍貴材料的搶救有較好的效果。研究發(fā)現(xiàn):可用成年植株主莖上帶頂芽和腋芽的枝條為材料,留用頂端部分做外植體。切除大葉柄,保留苗端和少數(shù)小(直徑1-2mm)葉柄。帶有腋芽的小葉柄切除基部后和苗端一起消毒,接種在含有BA與NAA的MS培養(yǎng)基上,葉柄腋部形成小植株,同樣可以分化成苗。開放式組織培養(yǎng)包括無菌體系的建立,在番木瓜上目前還沒有試用。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)消毒方法并在培養(yǎng)基內(nèi)添加一定濃度“山農(nóng)一號(hào)”,污染率大大下降(方法VI)。筆者還嘗試了浸泡一定濃度“山農(nóng)一號(hào)”、以及常規(guī)消毒與浸泡“山農(nóng)一號(hào)”相結(jié)合的四種處理,結(jié)果表明,常規(guī)消毒與8%的山農(nóng)一號(hào)I型溶液浸泡10-20min相結(jié)合