基于農(nóng)桿菌agrobaceriumuleen的黃瓜基因的整合

基于農(nóng)桿菌agrobaceriumuleen的黃瓜基因的整合

隨著黃瓜地帶的栽培面積不斷擴(kuò)大，連作過(guò)多的現(xiàn)象嚴(yán)重，根結(jié)線蟲對(duì)黃瓜生產(chǎn)的危害日益嚴(yán)重。而現(xiàn)有資源中缺乏抗南方根結(jié)線蟲的種質(zhì)資源,且通過(guò)傳統(tǒng)育種手段無(wú)法解決此問(wèn)題。因此需利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入新的外源遺傳資源來(lái)拓寬栽培黃瓜的遺傳基礎(chǔ)。黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化研究始于1986年(Trulsonetal.,1986),但在抗線蟲遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究較少。于玉梅(2008)構(gòu)建根結(jié)線蟲保守基因16D10的植物表達(dá)載體,通過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)導(dǎo)黃瓜,PCR檢測(cè)抗性苗有1株擴(kuò)增出特異條帶。然而利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)和花粉管通道法未能將16D10構(gòu)建的RNAi載體(朱妍妍,2008)及植物表達(dá)載體pCAM-BIA1301-16D和pCAMBIA1301-22-21(韓欣,2010)轉(zhuǎn)化黃瓜。魏愛(ài)民等(2006,2008)分析多種因素對(duì)EQKAM基因轉(zhuǎn)化黃瓜的影響,并利用花粉管通道法經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得抗性苗,但陽(yáng)性率低,僅為0.14%。此外,切割柱頭、子房注射和子房涂抹等方法在黃瓜上均有嘗試,實(shí)驗(yàn)證明只有切割柱頭和子房注射可將抗線蟲基因EQKAM轉(zhuǎn)入黃瓜(張文珠等,2009)?？梢?jiàn),黃瓜抗根結(jié)線蟲的遺傳轉(zhuǎn)化研究至今仍缺乏完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究旨在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將南方根結(jié)線蟲寄生相關(guān)基因的RNA干擾載體pRNAi-m1轉(zhuǎn)化黃瓜,通過(guò)Hyg濃度梯度篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株,以此建立黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系,為黃瓜抗線蟲的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料是從新泰密刺黃瓜(CucumissativusL.)中篩選出的純合自交系。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為EHA105,質(zhì)粒載體為pRNAi-m1,含有潮霉素抗性基因和線蟲寄生相關(guān)基因,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所病害組構(gòu)建。MS基本培養(yǎng)基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙酰丁香酮(AS)購(gòu)自Sigma(上海)生物技術(shù)公司。6-BA、ABA、IAA、AgNO3、頭孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、潮霉素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白胨均購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司。所配制的MS固體(液體)培養(yǎng)基和LB固體(液體)培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后于常溫保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所需試劑配制為母液后用一次性過(guò)濾器(0.22μm)過(guò)濾除菌,于–20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2種子外植體的制備取飽滿的黃瓜種子預(yù)浸泡2–3小時(shí),剝除種皮后用75%乙醇消毒約30秒,再用6.5%次氯酸鈉消毒15分鐘,用滅菌的去離子水反復(fù)沖洗5次后接種在MS培養(yǎng)基上,于黑暗中培養(yǎng)。種子在28°C條件下生長(zhǎng)1–2天,將子葉部分橫切成4塊,以獲得子葉外植體。以子葉節(jié)作外植體時(shí)要待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng),約4–5天后子葉呈直立狀態(tài)時(shí)切取,去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸,并在預(yù)培養(yǎng)基PM(表1)上培養(yǎng)2天。選取含有目的基因載體的農(nóng)桿菌單菌落,接種于50mg·L–1Kan和50mg·L–1Rif的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌,每分鐘250轉(zhuǎn),28°C過(guò)夜。當(dāng)OD=0.6–0.8時(shí)收集菌液,10000×g離心8–10分鐘,棄上清液,用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸菌體。菌液侵染前添加0.725mg·L–1AS(張若緯,2010)。1.3黃瓜再生植株的制備取切好的新鮮黃瓜子葉外植體于農(nóng)桿菌懸濁液中侵染15–20分鐘,取出后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面的菌液,接種在共培養(yǎng)基C1上,在25°C黑暗條件下培養(yǎng)2–3天。采用Hyg濃度為10mg·L–1的S1培養(yǎng)基對(duì)子葉進(jìn)行初步篩選,經(jīng)過(guò)3周的初步選擇后將Hyg濃度提高到25mg·L–1進(jìn)行高濃度篩選。在高濃度Hyg的選擇培養(yǎng)基S3中再培養(yǎng)1周,依舊保持綠色的再生植株可轉(zhuǎn)到BPM伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行伸長(zhǎng)、生根培養(yǎng)。子葉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù)。以相同培養(yǎng)條件下未使用Hyg篩選的黃瓜再生植株作為對(duì)照。預(yù)培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天的子葉節(jié)外植體在農(nóng)桿菌懸濁液中侵染15–20分鐘,取出后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面的菌液,接種于共培養(yǎng)基C2上,于25°C黑暗條件下培養(yǎng)2–3天。共培養(yǎng)后先采用Hyg濃度為7mg·L–1的S2培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選,經(jīng)過(guò)2周的選擇,再用Hyg濃度為15mg·L–1的S4培養(yǎng)基對(duì)子葉節(jié)進(jìn)行高濃度篩選。高濃度選擇1周后,將保持綠色的再生植株轉(zhuǎn)入BPM伸長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行伸長(zhǎng)、生根培養(yǎng)。子葉節(jié)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù)。以相同培養(yǎng)條件下未經(jīng)Hyg篩選的黃瓜再生植株作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)技術(shù)已申請(qǐng)專利。此外,對(duì)在預(yù)培養(yǎng)基PM上培養(yǎng)2天的黃瓜子葉節(jié)外植體持續(xù)用15mg·L–1Hyg進(jìn)行高濃度篩選。所用的共培養(yǎng)基為C2,選擇培養(yǎng)基為S4。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。以相同培養(yǎng)條件下未使用Hyg篩選的黃瓜再生植株作為對(duì)照。發(fā)育正常的黃瓜再生植株首先在三角瓶中開(kāi)始馴化,3–5天后將培養(yǎng)瓶的封口膜逐步去掉,以降低瓶中的濕度。然后將根系清洗干凈移植到花盆中,保濕1周后,黃瓜再生植株便可在溫室條件下正常生長(zhǎng)。1.4pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和轉(zhuǎn)膜檢測(cè)首先進(jìn)行PCR檢測(cè)。以黃瓜轉(zhuǎn)化植株和陰性對(duì)照植株的總DNA為模板,根據(jù)載體和目的基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,預(yù)擴(kuò)增片段大小為525bp。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C4分鐘;94°C30秒,53°C30秒,72°C2分鐘,32個(gè)循環(huán);72°C10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增目的條帶并拍照。Southern-blot檢測(cè)按照Sambroook等(1989)的方法。用EcoRI酶切約15–20μg的黃瓜基因組DNA,37°C溫浴過(guò)夜。在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離,用20×SSC轉(zhuǎn)膜,于120°C固定20分鐘,雜交過(guò)夜。利用Roche地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記含目的片段的質(zhì)粒DNA的PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行雜交,最后進(jìn)行洗膜、顯色和定影。1.5每外植體個(gè)/外植體轉(zhuǎn)化效率%相關(guān)參數(shù)的計(jì)算公式如下:再生頻率(%)=分化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;每外植體抗性芽數(shù)(個(gè)/外植體)=抗性芽數(shù)/外植體總數(shù);轉(zhuǎn)化效率(%)=PCR或Southern-blot陽(yáng)性植株數(shù)/再生植株總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。2結(jié)果與討論2.1再生芽的制備子葉外植體在初步選擇培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng)可發(fā)育出再生芽。將抗性芽轉(zhuǎn)入高濃度選擇培養(yǎng)基后,一些假陽(yáng)性再生芽變黃并停止生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)1個(gè)月先低后高濃度的Hyg梯度選擇,將始終保持綠色的抗性芽轉(zhuǎn)到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),2–3周后可發(fā)育為完整植株并繼續(xù)進(jìn)行馴化。子葉節(jié)在低濃度抗生素培養(yǎng)基上篩選2周后可見(jiàn)發(fā)育出的小芽點(diǎn),再經(jīng)高濃度篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)1周可發(fā)育為再生芽。對(duì)保持綠色的再生抗性芽進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng),1–2周后可獲得完整植株,然后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基進(jìn)行馴化(圖1)。2.2不同hyg篩選的葉節(jié)外植體對(duì)3.黃瓜子葉和子葉節(jié)經(jīng)Hyg濃度梯度篩選的再生頻率見(jiàn)表2。子葉外植體在10mg·L–1(低濃度)Hyg條件下經(jīng)3周的初步篩選再生頻率為76.5%,但多為伸長(zhǎng)困難的叢生芽。后經(jīng)25mg·L–1(高濃度)Hyg選擇,仍保持綠色的抗性植株率降低到8.8%,與未進(jìn)行Hyg篩選的子葉對(duì)照(再生頻率為82.7%)之間存在極顯著差異。子葉節(jié)外植體在7mg·L–1Hyg低選擇壓力下經(jīng)過(guò)2周的初步篩選,再生頻率為51.8%,又經(jīng)15mg·L–1Hyg高濃度選擇后,抗性植株率降低到29.6%,同樣與未經(jīng)Hyg篩選的子葉節(jié)對(duì)照之間呈極顯著差異。表2數(shù)據(jù)證明采用逐步提高的Hyg濃度梯度篩選可極顯著降低黃瓜外植體抗性芽頻率,有效減少假陽(yáng)性植株。2.3農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率提取通過(guò)誘導(dǎo)子葉和子葉節(jié)獲得的黃瓜再生植株的DNA,對(duì)基因組DNA進(jìn)行目的條帶擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒DNA,陰性對(duì)照為未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的黃瓜植株(圖2)。通過(guò)10和25mg·L–1Hyg濃度梯度對(duì)子葉再生植株進(jìn)行篩選后共獲得37株抗性植株,其中有12株P(guān)CR產(chǎn)物擴(kuò)增出目的條帶,平均陽(yáng)性率為27.8%。而子葉節(jié)外植體經(jīng)7和15mg·L–1Hyg濃度梯度篩選后獲得62株再生植株,其中13株擴(kuò)增出目的條帶,平均陽(yáng)性率為19.3%。表3數(shù)據(jù)顯示,通過(guò)黃瓜子葉途徑誘導(dǎo)獲得的再生植株P(guān)CR陽(yáng)性率高于子葉節(jié)途徑,初步證明以黃瓜子葉外植體為介質(zhì)進(jìn)行農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的效率更高。利用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,子葉外植體通過(guò)7和15mg·L–1Hyg梯度選擇獲得的抗性植株的PCR平均陽(yáng)性率為27.8%,較未使用Hyg選擇的對(duì)照平均陽(yáng)性率(22.4%)有顯著升高。但在子葉節(jié)實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)Hyg梯度篩選獲得抗性植株的PCR陽(yáng)性率與未經(jīng)Hyg選擇的對(duì)照之間無(wú)顯著差異。PCR檢測(cè)證明子葉經(jīng)過(guò)Hyg梯度篩選可顯著提高抗性植株的陽(yáng)性率,有效剔除假陽(yáng)性植株。2.4黃秋葵葉節(jié)再生植株與黃瓜抗性植株的構(gòu)建將PCR陽(yáng)性的子葉再生植株提取基因組總DNA,用Roche地高辛試劑盒標(biāo)記探針,經(jīng)Southern-blot檢測(cè),有5株出現(xiàn)了雜交信號(hào)(圖3),平均陽(yáng)性率為13.9%。同時(shí)通過(guò)雜交條帶數(shù)可看出目的基因均以單拷貝形式插入基因組中。將PCR陽(yáng)性的子葉節(jié)再生植株提取基因組DNA進(jìn)行Southern-blot檢測(cè),結(jié)果也有5株出現(xiàn)了雜交信號(hào),平均陽(yáng)性率為6.9%。Southern-blot檢測(cè)結(jié)果證明誘導(dǎo)子葉獲得的陽(yáng)性植株率比子葉節(jié)途徑高,這與PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。黃瓜抗性植株的Southern-blot驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。利用SAS軟件分析表明,子葉外植體通過(guò)Hyg梯度(7和15mg·L–1)選擇獲得的抗性植株的Southern-blot平均陽(yáng)性率為13.9%,比未使用Hyg梯度選擇的對(duì)照陽(yáng)性率(4.1%)呈極顯著升高。在子葉節(jié)途徑中也獲得了相同的結(jié)論,即Hyg梯度(10和25mg·L–1)篩選獲得抗性植株的Southern-blot陽(yáng)性率比未經(jīng)Hyg梯度選擇的對(duì)照有極顯著水平的提高。檢測(cè)結(jié)果證明Hyg梯度篩選可顯著提高子葉和子葉節(jié)再生抗性植株的陽(yáng)性率,有效剔除非轉(zhuǎn)化植株。2.5外植體高h(yuǎn)yg濃度梯度選擇采用不同濃度的Hyg對(duì)黃瓜子葉節(jié)進(jìn)行篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。與未經(jīng)Hyg篩選的對(duì)照相比,持續(xù)高濃度Hyg篩選和先低后高的Hyg濃度梯度選擇都會(huì)極顯著降低外植體的再生頻率。而PCR陽(yáng)性率在CK、15mg·L–1Hyg和Hyg梯度篩選這3種處理間均無(wú)顯著差異。但Southern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,通過(guò)Hyg梯度篩選的抗性植株的陽(yáng)性率極顯著高于對(duì)照和持續(xù)用15mg·L–1Hyg高濃度篩選,再次證明對(duì)黃瓜子葉節(jié)進(jìn)行7和15mg·L–1Hyg梯度篩選的有效性。2.6討論2.6.1細(xì)胞分化和生物降解在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法中,絕大多數(shù)體系從開(kāi)始就采用高濃度抗生素進(jìn)行篩選,但鑒于黃瓜植株對(duì)抗生素類選擇劑極其敏感,因此轉(zhuǎn)化效率普遍不高。究其原因是在誘導(dǎo)分化初期采用高濃度的抗生素會(huì)抑制部分代謝尚未完全正常的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)(張守杰,2011),在這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化出新細(xì)胞或組織前就已將其殺死。因此傳統(tǒng)的持續(xù)高濃度篩選過(guò)程使黃瓜轉(zhuǎn)化效率普遍較低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用逐步提高的Hyg濃度對(duì)子葉節(jié)進(jìn)行篩選,比始終采用高濃度Hyg篩選獲得的抗性植株更多,且PCR和Southern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性率也更高,為黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化提供了更高效的方法。在細(xì)胞分化之初僅采用低濃度抗生素篩選,使轉(zhuǎn)化細(xì)胞得到更多生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)會(huì),從而在最大程度上保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)。待芽原基發(fā)育完成后,進(jìn)一步提高抗生素濃度來(lái)剔除其中的假陽(yáng)性植株。這是利用Hyg濃度梯度篩選獲得較其它黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化方法更高轉(zhuǎn)化效率的重要原因。隨著遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展,改用其它非抗性標(biāo)記基因如GFP(Selvarajetal.,2010)可能會(huì)使黃瓜在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)抗生素敏感問(wèn)題有所改善。2.6.2不同外植體的誘導(dǎo)分化能力和抗性和基因型別本研究結(jié)果表明,子葉和子葉節(jié)在再生頻率和抗性植株陽(yáng)性率上均存在較大差異,子葉節(jié)的優(yōu)勢(shì)在于生長(zhǎng)周期短,莖的伸長(zhǎng)和生根過(guò)程不存在較大困難,但假陽(yáng)性率較高,達(dá)到93.1%;而子葉外植體雖然誘導(dǎo)分化困難,成苗率低,但再生芽可以耐受高濃度的抗生素篩選,假陽(yáng)性率為86.1%。篩選過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),子葉外植體上的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在篩選初期便能在10mg·L–1Hyg下保持分化能力,當(dāng)Hyg濃度提高到25mg·L–1時(shí)還可以保持綠色,經(jīng)過(guò)約5周的梯度選擇到成苗階段時(shí)甚至可以耐受30mg·L–1Hyg。而從子葉節(jié)外植體上獲得的再生植株在Hyg濃度提高到12mg·L–1就開(kāi)始白化,Hyg濃度提高到20mg·L–1時(shí)則基本全部白化。子葉外植體上獲得的抗性植株對(duì)Hyg耐受能力更強(qiáng)的原因在于進(jìn)行子葉侵染的時(shí)期比子葉節(jié)要提前3–4天,即2種外植體所處的發(fā)育期不同,誘導(dǎo)分化期開(kāi)始越早的分化組織似乎分生能力越強(qiáng)