分子生物學(xué)研究法 (下)

分子生物學(xué)研究法(下)

第六章

分子生物學(xué)研究方法(下)本章主要內(nèi)容基因表達(dá)研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)及研究技術(shù)1基因改造技術(shù)（1）體外改造1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal31酶切→連接酶。2）點(diǎn)突變：DNA→變性→與突變的引物雜交→聚合反應(yīng)，連接反應(yīng)。定點(diǎn)突變（site-directedmutagenesis）是指通過PCR等方法向目的DNA片段中引入點(diǎn)突變，使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失等。定點(diǎn)突變能迅速和高效地改變DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要研究手段?；虻捏w外改造（2）體內(nèi)改造基因敲除：是一種基因打靶技術(shù)。主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段；也可通過插入突變,使靶基因失活。1）同源重組2）非同源重組

2.1凝膠阻滯試驗(yàn)（gelretardationassay）凝膠阻滯試驗(yàn)，又叫作DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay,EMSA），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對數(shù)成反比。若此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。

當(dāng)某個(gè)DNA片段與細(xì)胞提取物混合之后，若它在凝膠電泳中的移動(dòng)距離變小了，就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合了。2DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于與一種細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合

2.2DNaseI足跡試驗(yàn)（DNAfoot-printingassay）將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，并用限制性內(nèi)切酶去掉其中的一個(gè)末端，得到只有一條鏈單個(gè)末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子，與細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿著靶DNA作隨機(jī)單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條DNA單鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。

若蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)DNaseI消化之后便會(huì)產(chǎn)生出距放射性標(biāo)記末端1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)核苷酸等一系列長度僅相差一個(gè)核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。若有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它將保護(hù)這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不能產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割條帶。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒有放射標(biāo)記條帶的空白區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡”。32p1510*14810*加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510AB足跡(a)(c)(b)DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)3酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast-twohybridsystem)酵母雙雜交體系也叫interactiontrap（相互作用陷井），是上世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來的一種敏感的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，也是體內(nèi)鑒定基因的方法?？捎行У赜脕矸蛛x能與一種已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一種蛋白質(zhì)及其編碼基因，而且還可以用來確定蛋白質(zhì)相互作用的特異性結(jié)構(gòu)域及其氨基酸序列。

酵母雙雜交體系在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤基因表達(dá)等諸多的研究領(lǐng)域，都有著廣泛的應(yīng)用。a.DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，它可識(shí)別效應(yīng)基因上游的一段特定的區(qū)段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并與之結(jié)合。b.轉(zhuǎn)錄激活域(Transcriptionalactivationdomain,AD)，它通過與轉(zhuǎn)錄機(jī)器(transcriptionmachinery)中其它成分的結(jié)合作用，以啟動(dòng)UAS下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域酵母半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄因子-GAL4研究發(fā)現(xiàn)，真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。

在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸區(qū)有一個(gè)DNA結(jié)合域(DNA-BD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸區(qū)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。一般情況下，BD能與GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。按照所用轉(zhuǎn)錄因子的異同，可將酵母雙雜交體系分為LexA和GAL4兩個(gè)類型，在此以GAL4類型為例。若將BD和AD這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)分別克隆到兩個(gè)載體中,再把它們轉(zhuǎn)入同一寄主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，由此產(chǎn)生的GAL4DNA-BD和GAL4AD多肽，由于彼此之間不直接發(fā)生相互作用，所以不能激活其相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。若將上述分開的兩種結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)重新組裝成具有功能活性的轉(zhuǎn)錄因子，則能激活下游報(bào)告基因進(jìn)行表達(dá)。（1）構(gòu)建兩種E.coli-Yeast穿梭質(zhì)粒載體通常將此種與BD融合的蛋白質(zhì)叫做誘餌蛋白質(zhì)(Baitprotein)

1）第一種質(zhì)粒載體pGBT9，這種質(zhì)粒載體又叫做誘餌質(zhì)粒載體或DNA-BD質(zhì)粒載體(具trp基因)。酵母雙雜交體系的構(gòu)建過程把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上。2）第二種質(zhì)粒載體pGAD424，又叫做文庫質(zhì)粒載體或AD質(zhì)粒載體，它具有亮氨酸基因(leu)，是用來構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫的專用載體。形成第二種雜種蛋白質(zhì)(Y)。這種與AD融合的蛋白質(zhì)叫做基因文庫編碼蛋白質(zhì)，其中可與誘餌蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的特稱為獵物蛋白質(zhì)(preyprotein)把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。（2）酵母雙雜交體系的寄主菌株

將釀酒酵母基因組中的GAL4的編碼基因剔除掉，發(fā)展成酵母雙雜交體系轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的寄主菌株。例如SFY526和HF7c等。SFY526菌株：HF7c菌株：(a)喪失了表達(dá)內(nèi)源GAL4轉(zhuǎn)錄因子的能力。(b)具有l(wèi)acZ報(bào)告基因。(c)trp1和leu2轉(zhuǎn)化標(biāo)記，在無Trp和Leu的培養(yǎng)基中不生長。(a)喪失了表達(dá)內(nèi)源GAL4轉(zhuǎn)錄因子的能力。(b)具有His3和LacZ報(bào)告基因。(c)trp1和leu2轉(zhuǎn)化標(biāo)記，在無Trp和Leu的培養(yǎng)基中不生長。（3）共轉(zhuǎn)化從大腸桿菌細(xì)胞中分別提取雜種質(zhì)粒I和雜種質(zhì)粒Ⅱ，并共轉(zhuǎn)化酵母菌株(例如)HF7c。涂布在選擇培養(yǎng)基(缺少His、Leu和Trp三種氨基酸)上，以便篩選那些表達(dá)相互作用的雜種蛋白質(zhì)的菌落。1）如果已知蛋白質(zhì)同一種由文庫編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用，則構(gòu)成了一種有功能的GAL4轉(zhuǎn)錄因子。2）這種有功能活性的GAL4轉(zhuǎn)錄因子能識(shí)別GAL4效應(yīng)基因上游的激活序列(GAL4UAS)，從而啟動(dòng)下游報(bào)告基因(lacZ或his3)的表達(dá)。3）若報(bào)告基因是lacZ,則可通過顯色反應(yīng)篩選陽性克隆。酵母雙雜交基本原理示意圖AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因GAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因ADYGAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄XDNABDADYXDNABD(a)(b)(c)總結(jié)：酵母雙雜交系統(tǒng)是一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其系統(tǒng)組成及原理如下：GAL4蛋白是酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子，具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，BD；位于氨基端1～147氨基酸）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptionalactivatingdomain，AD；位于羧基端768～881氨基酸）。為了研究已知蛋白X與未知蛋白Y之間是否能夠相互作用，則將GAL4的BD編碼區(qū)cDNA與蛋白X的cDNA按正確的ORF閱讀框連接在一起，構(gòu)建一重組質(zhì)粒；同理，將GAL4的AD的cDNA與蛋白Y的cDNA連接在一起，構(gòu)建另一重組質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化工程酵母菌（其編碼GAL4的基因已缺損），則二者分別表達(dá)融合蛋白“BD-X”（“誘餌”，bait）和“AD-Y”）（“獵物”或靶蛋白，preyortargetprotein)。若蛋白X和Y二者之間在酵母細(xì)胞核內(nèi)能夠發(fā)生相互作用，則相當(dāng)于將原來已拆開的BD和AD又連在了一起，GAL4的活性被恢復(fù)，識(shí)別并結(jié)合于特異的DNA調(diào)控元件上，進(jìn)而激活其下游報(bào)告基因（如lacZ）的表達(dá)。若X與Y不發(fā)生相互作用，則報(bào)告基因不表達(dá)。即，通過檢測報(bào)告基因是否表達(dá)，就可分析蛋白X與Y二者之間是否發(fā)生了相互作用。生物芯片的概念及其種類和作用生物芯片（biochip）是指通過微電子、微加工技術(shù)在芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)及其它生物組分的快速、敏感、高效的處理。生物芯片可以分為DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片和其它芯片三類。其中前兩者屬于檢測芯片。（1）DNA芯片可以通過雜交來檢測樣品中的核酸，也可以利用雙鏈DNA與蛋白質(zhì)的相互作用來檢測蛋白質(zhì)。（2）蛋白質(zhì)芯片利用蛋白質(zhì)間的相互作用如抗原-抗體反應(yīng)或受體-配體之間的特異作用來進(jìn)行檢測。（3）其它生物芯片有樣品制備芯片、核酸擴(kuò)增芯片、毛細(xì)管電泳芯片等，即在芯片上分別進(jìn)行樣品的分離、擴(kuò)增、生化反應(yīng)等過程。4基因芯片DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（insitusynthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號(hào)的檢測分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又稱為基因芯片（genechips）、DNA微陣列（DNAmicroarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotidearray）等?；蛐酒瑱z測原理和步驟舉例(1)制作芯片：將核苷酸序列探針，固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬個(gè)探針。（2）從被測對象的細(xì)胞中提取DNA，用酶切成較小的片段，并對DNA作熒光標(biāo)記，并熔解成單鏈。（3）將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交，凡是與探針互補(bǔ)的酶切片段會(huì)固定于特定位置上，不能互補(bǔ)的片段會(huì)被洗脫掉。（4）對芯片上的熒光作掃描和分析。DNA微陣列技術(shù)示意圖微陣列雜交圖

5RNAi(RNAinterference)技術(shù)（1）相關(guān)概念

RNAi(RNAinterference，RNAi):是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。當(dāng)向細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的dsRNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。RNAi具有特異性和高效性。此現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默。RNAi是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，具有重大生物學(xué)意義。siRNA（smallinterferingRNAs）是一種由Dicer酶切dsRNA而來的短片斷雙鏈RNA分子(21-23bp)，參與RAN干擾過程。

Dicer：是一種RNaseIII,能特異識(shí)別和逐步切割外源雙鏈RNA，將RNA降解為21-23bp的雙鏈RNAs(siRNAs)。

RISC（RNA-inducedsilencingcomplex,誘導(dǎo)沉默復(fù)合物）：由siRNA、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。(2)作用機(jī)制長片斷雙鏈RNADicer酶ATPADP+PisiRNA(21-25bp)蛋白復(fù)合物形成階段siRNP雙鏈RNA解鏈階段ATPADP+PiRISC識(shí)別并降解目標(biāo)RNA激活RISC需要一個(gè)依賴ATP的將siRNA解離為單鏈的過程?；罨腞ISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下通過堿基配對識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下，在距離siRNA3ˊ端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。最后靶mRNA可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。6噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示（phagedisplay）技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物與親和選擇相結(jié)合的技術(shù)。以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，再通過親和富集法篩選表達(dá)外源蛋白的噬菌體。其建立基于三個(gè)原因：

(1)形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)保持有外源蛋白的活性。(2)利用固定于固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵?panning)方法，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體。通過多輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程，即噬菌體與靶分子結(jié)合而被保留，未吸附的噬菌體則被洗去，吸附的噬菌體可以從表面再回收，再感染細(xì)菌，從而大量富集噬菌體。(3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)于噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分，可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序被推導(dǎo)出來。從噬菌體抗體庫中篩選特異性抗體經(jīng)典方法主要有兩種：1)將純抗原包被在固相介質(zhì)上，如酶標(biāo)板或親和層析柱，然后加入待篩選的噬菌體，洗去非親和性或低親和性的噬菌體，回收高親和性的噬菌體。2)將抗原與生物素基團(tuán)相連，再將其固定在包被有鏈霉抗生物素蛋白的磁珠上對噬菌體進(jìn)行篩選。

反義RNA技術(shù)反義RNA是指與靶RNA(多為mRNA)互補(bǔ)的RNA分子。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制,可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA技術(shù)示意圖7研究基因差異表達(dá)的主要技術(shù)差別雜交（篩選）（differentialhybridization）扣除（消減）雜交（subtractivehybridizationofcDNA，SHD）mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，DD）抑制消減雜交法（suppressionsubtractivehybridization,SSH）代表性差異分析（representialdisplayanalysis，RDA）交互扣除RNA差別顯示（reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay）基因表達(dá)系列（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）分析電子消減（electronicsubtraction）DNA微列陣分析（DNAmicroarray）

根據(jù)表達(dá)特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因（house-keepinggene），以其組成型表達(dá)模式維持細(xì)胞的基本代謝活動(dòng);而把在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細(xì)胞中發(fā)生的按時(shí)間、空間進(jìn)行有序表達(dá)的基因稱為差別表達(dá)（differentialexpression）基因。1992年，美國波士頓Dena-Farber癌癥研究所的兩位科學(xué)家P.Liang和A.D.Pardee發(fā)明了一種叫